牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗缪勒氏管激素Ⅱ型受体基因(amhr2)表达特征分析及功能初探

抗缪勒氏管激素Ⅱ型受体(anti-Müllerian hormone receptorⅡ,Amhr2)是抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,Amh)的特异受体。amhr2基因在鱼类性腺分化和发育中发挥重要作用,更决定了有的鱼种的性别,然而,相关功能研究较为有限。本研究旨在明晰amhr2在我国重要海水养殖鱼类—牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺分化和发育过程中的表达特征,并初步探究其功能。首先,克隆了牙鲆amhr2-CDS序列,共1536bp,编码511个氨基酸。系统发育分析显示牙鲆Amhr2近C端较为保守,与其他硬骨鱼类聚为一枝,并与上游sp1以及下游的prr13和PCBP2在基因组中共定位。蛋白结构分析显示,牙鲆Amhr2包含信号肽、跨膜结构域和保守的酪氨酸蛋白激酶结构域。进而,利用实时荧光定量PCR(q PCR)分析表明,牙鲆amhr2主要表达于性腺,且在精巢中的表达极显著高于卵巢(P<0.01),其在I-V期精巢中持续高表达,而在卵巢中仅在I期高表达,后显著下降(P<0.05)。性腺分化期基因的表达,是对雌核发育组(对照组,20±0.5℃,100%雌性)与雌核发育高温诱导组(HT组,28±0.5℃,100%雄性)鱼苗进行检测的,amhr2在对照组全长(totallength,TL)2cm的实验鱼性腺中表达最高,后逐渐下降;而HT组实验鱼性腺中的表达呈现先上升后下降的趋势,并在精巢开始分化的6cm TL时表达最高。利用Hela细胞进行亚细胞定位分析发现,Amhr2与其配体Amh均定位于细胞质。同时,通过原核表达重组牙鲆Amh,并用其孵育离体性腺组织,q PCR分析显示精巢中amhr2的表达没有显著变化,但卵巢中表达显著上升(P<0.05)。进一步通过双荧光素酶报告分析表明,Amh和Amhr2共转染能够显著抑制雌激素合成的关键芳香化酶基因cyp19a的表达(P<0.01)。综上所述,牙鲆amhr2主要表达于精巢,但在不同性腺发育时期表达不同,且其可能与Amh共同影响cyp19a的转录,对雄性表型形成的启动和性腺发育起作用。

牙鲆mstn基因SNPs位点多态性与生长性状的关联分析

为研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉生长抑制基因(mstn)多态性,开发其分子辅助育种新标记,采用重测序方法对120尾牙鲆(3个双克隆杂交家系:60尾;3个雌核发育家系:60尾)的mstn基因进行单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对不同基因型个体的生长性状进行多重比较及SNP标记验证。结果显示,共检测到7个SNPs位点,均为颠换型突变;外显子区3个(Exonl 1:G2063A;Exonl 3:C3883T,C4009A),为同义突变;内含子区3个(Intron 1:A2444T;Intron 2:T3816C,A3832C);3'端非编码区1个(3'UTR:C4564A)。SNPs与生长性状关联分析结果表明,A3832C和C4564A标记位点与牙鲆体质量、体长、体高等生长性状显著相关(P<0.05),其中A3832C位点AA基因型和C4564A位点AC基因型在生长上表现出优势,A3832C位点CC和C4564A位点AA、CC基因型在生长上表现出劣势,其他5个SNPs位点对牙鲆生长性状影响不显著(P>0.05)。将A3832C和C4564A标记位点在牙鲆生长快速群体(F:60尾)和生长缓慢群体(S:60尾)中验证,验证结果与多重比对结果一致,表明2个SNPs位点具有较高的稳定性。综上所述,研究筛选出了牙鲆mstn基因中与生长性状显著相关的A3832C和C4564A两个标记位点,为牙鲆分子辅助育种提供了理论参考。

基于Ecopath模型的长山列岛邻近海域褐牙鲆增殖生态容量研究

为确定长山列岛邻近海域褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)增殖放流的合理容量,本文基于2016-2017年长山列岛邻近海域渔业资源与生态环境季度调查数据,构建了包括29个功能组的长山列岛邻近海域生态系统Ecopath模型,分析了该海域生态系统的能量流动特征,评估了放流种褐牙鲆的生态容量。研究表明:长山列岛邻近海域生态系统的营养级范围为1~4.57,总能量转换效率为6.23%,总初级生产量/总呼吸(TPP/TR)为1.47,总初级生产量/总生物量(TPP/TB)为26.87,循环指数(FCI)为6.91%,连接指数(CI)为0.24。长山列岛邻近海域褐牙鲆增殖生态容量为0.0143 t·km^(-2),约为该海域褐牙鲆当前生物量的1.55倍。褐牙鲆生物量达到生态容量时,长山列岛邻近海域生态系统的能量转换效率略有增加,总消耗量、总输出量等其他参数基本不受影响。

锦州市海域褐牙鲆增殖放流效果调查评估

为评估褐牙鲆增殖放流效果,在放流海域开展了资源调查,结果发现,褐牙鲆出现的数量及质量在7、8月份处在最高值,9月份后,开海捕捞,单次渔获中褐牙鲆的数量和质量呈下降趋势。从10次调查的渔获物的组成看,通过近三年的褐牙鲆资源增殖放流,褐牙鲆资源有所恢复。

山东近海牙鲆(Paralichthys olivaceus)自然和养殖群体10个微卫星基因座位的遗传多态性分析

采用微卫星遗传标记技术对山东近海牙鲆自然群体和养殖群体的遗传多样性进行了研究。实验所用牙鲆于 2 0 0 3年 5月分别采自山东近海和青岛胶南养鱼场 ,各 2 0尾 ,取全血或肌肉组织 ,以酚 仿抽提方法提取基因组DNA ,利用筛选获得的 1 0对微卫星引物进行PCR扩增 ,反应产物经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、EB显色 ,用ImageMaster1DElite(Version3 0 1 )软件分析电泳结果 ,并计算了相应的遗传学参数。结果表明 ,在自然和养殖群体中 ,1 0个基因座位的等位基因平均数 (a)分别为 6 7和 6 1 ,每个基因座位有效等位基因数 (ae)分别为1 8— 6 8和 2 5— 6 7,群体平均杂合度 (H)分别为 0 81 2 0和 0 731 0 ;两个群体间的遗传相似性系数、遗传距离和基因分化系数为 0 85 5 8、0 1 5 5 7和 0 0 5 5 8;自然群体内每个座位上的多态信息含量 (PIC)为 0 5 9— 0 84、个体识别率 (DP)为 0 5 4— 0 86、非父排除率 (PPE)为 0 41— 0 72 ,其累积个体识别率和非父排除率均达到 0 9999,表明所选座位属中高识别力的遗传标记 ,可以将它们应用于今后牙鲆雌核发育群体的遗传变异分析以及进一步的遗传育种的研究中。

显微注射抗冻剂对牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎毒性及冷敏感性的影响

在鱼类胚胎冷冻保存中,由于胚胎体积大、卵膜具多层结构,并且通透性差,传统的平衡法无法使抗冻剂足够、有效的进入胚胎内部起到保护作用。为弥补了普通平衡法的不足,此研究利用显微注射技术,将抗冻剂直接注射到鱼类胚胎卵黄囊内,提高了抗冻剂对胚胎的保护程度。此研究以牙鲆胚胎为试验材料,对显微注射抗冻剂种类、抗冻剂的注射剂量、注射浓度、以及抗冻剂注射后胚胎的冷敏感性影响进行了筛选。结果表明:牙鲆胚胎较适宜的显微注射剂量为750pl;几种抗冻剂注射牙鲆胚胎后的毒性大小相对排列为PVP>蔗糖,DMSO>MeOH>PG,其中注射PG获得的胚胎成活率和孵化率最高,注射PVP获得的胚胎成活率和孵化率最低,而PG与MeOH组成混合抗冻剂PM毒性更低获得的胚胎成活率和孵化率更高。而任何一种抗冻剂均随着浓度的增加其毒性随之增加;另外,在冷敏感试验中,显微注射6mol/L的PM的胚胎胚胎,应用程序化法处理,以2℃/min的速率由室温降至-20℃,平衡10min后解冻处理,发现注射PM的胚胎低温处理后成活率为(25.07±1.57)%,而6mol/的PM五步平衡法同步处理的对照组胚胎成活率为(20.88±2.84)%,说明显微注射的胚胎冷敏感性一定降低。

盐度对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼血浆渗透压和鳃丝Na^+-K^+-ATPase活力的影响

采用微型冰点渗透压仪和酶学分析的方法测定了褐牙鲆幼鱼由盐度30向低盐(24、18、12、6)适应过程中血浆渗透压和鳃丝Na^+-K^+-ATPase活力的变化。结果表明,盐度对褐牙鲆幼鱼血浆渗透压和鳃丝Na^+-K^+-ATPase活力都有显著的影响(P<0·05)。盐度变化后,各实验组褐牙鲆血浆渗透压、鳃丝Na^+-K^+-ATPase活力均呈现出不同程度的下降趋势,且随着盐度变化的增加而增大。在6d内,盐度为18、12和6实验组血浆渗透压呈峰值变化,在3d时达到最小值;6d后,各实验组血浆渗透压趋于稳定;而鳃丝Na^+-K^+-ATPase活力在6d时达到最小值,9d后,各实验组褐牙鲆鳃丝Na^+-K^+-ATPase活力基本趋于稳定状态,而且在高渗环境(S>14·97)中鳃丝Na^+-K^+-ATPase活力与外界盐度大小呈正比,在低渗环境(S<14·97)中与盐度呈反比。褐牙鲆幼鱼的等渗点盐度为14·97,等渗压为425·8mOsm/kg。

野生和养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)遗传差异的RAPD和ISSR研究

利用RAPD和ISSR两种分子标记技术,分析了山东威海近海野生和养殖牙鲆的遗传多样性差异。结果表明,用10个RAPD引物对两个样本各30个个体的基因组DNA进行扩增,共获得110个重复性好且带谱清晰的扩增位点,片段大小在200—2500bp之间,野生样本和养殖样本的多态位点比例分别为59.09%和60·91%,Shannon多样性值分别为16·563和16·917,野生样本内平均遗传距离为0·17427,养殖样本为0·17553,样本间遗传距离为0·17419。用6个ISSR引物共在两样本中检测到161个位点,野生样本有111个(68·94%)为多态位点,养殖样本有112个(69·57%)为多态位点,野生和养殖样本的样本内平均遗传距离分别为0·19996和0·20007,样本间遗传距离为0·20002,Shannon多样性值分别为29·254和29·688。平均位点多态率显著性检验标明,无论是利用RAPD还是ISSR技术,两群体间平均位点多态率皆差异不显著,说明第一代养殖群体的遗传结构尚未发生明显变化。

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。

铜在牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织蓄积、分配及排放的研究

采用暴露实验方法 ,研究了海水中Cu在牙鲆 (Paralichthysolivaceus)内脏、肌肉、鳃组织内吸收、积累和排放规律 ,海水中总有机碳 (TOC)浓度、配体种类对铜吸收的影响及其与海水表观络合容量 (ACuCC)的关系。结果表明 ,Cu浓度为 0 .5mg/L时 ,各组织内Cu蓄积量随暴露时间增加而增大 ,第 1 3天均达吸收平衡 ,此时Cu蓄积量 (mg/kg)为内脏 971 .89>肌肉 2 0 4 .99>鳃 90 .0 4。染毒 1 3天牙鲆在清洁海水中排放结果表明 :随排放时间增加各组织Cu蓄积量下降 ,第 8天接近排放平衡。此时各组织Cu排出率为 :肌肉 89% >鳃 86.5 % >内脏团 83.7%。海水中TOC浓度、种类对牙鲆Cu蓄积有明显影响 ,当TOC浓度相同时 ,孔石莼分泌物比牙鲆分泌物更能降低Cu在牙鲆组织内吸收和蓄积量 ;当TOC种类相同时 ,随TOC浓度升高 ,各组织铜蓄积量均明显下降 ,表明海水TOC能降低牙鲆组织对Cu的吸收和积累。ACuCC随TOC浓度增加有明显上升趋势 ,并与TOC浓度呈线性相关。

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)养殖群体微卫星座位遗传多态性的分析

为了解漠斑牙鲆群体的遗传背景，并为漠斑牙鲆人工养殖业健康和可持续发展提供理论依据，利用筛选获得的10对微卫星引物对漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）养殖群体进行了群体遗传学分析。该群体等位基因平均数为4．0，平均杂合度为0．597 7。各多态座位的有效等位基因数则为1．7～4．1，多态座位杂合度的观察值为0．2917～O．9583，无偏倚期望值范围为0．4053～O．7553，Hardy-Weinberg遗传偏离指数为－0．4517～0．3466。每个座位上的多态信息含量为0．353-0．746，个体识别率为0．176～0．559，非父排除率为0．405～0．755，其累积个体识别率和非父排除率均达到0．9999和0．9937，这些座位均属中识别力以上的遗传标记，可以应用于今后的漠斑牙鲆的遗传育种（如雌核发育等）研究。

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对牙鲆(Paralichthys olivaceus)粘液的趋化和粘附作用

采用生长曲线法测定了河流弧菌在牙鲆表皮、鳃和肠粘液中的生长情况,结果表明,河流弧菌在3种粘液中都能生长,生长前期符合Logistic模型,然后进入Gompertz模型,在鳃粘液中的生长量高于肠粘液和表皮粘液。采用毛细管法研究了河流弧菌对牙鲆3种粘液的趋化作用,结果表明,河流弧菌对牙鲆3种粘液具有较强的趋化应答,在粘液总蛋白含量相同的情况下,河流弧菌对牙鲆鳃粘液的趋化应答显著强于对表皮粘液的趋化应答(P<0.05),而对肠粘液的趋化应答极显著低于对鳃粘液和表皮粘液的趋化应答(P<0.01)。采用3H-TdR示踪法进行了河流弧菌对牙鲆3种粘液的粘附作用研究,结果表明,河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率较高,而对肠粘液的粘附率较低,特别是孵育30、60和90min时河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率显著高于对肠粘液的粘附率(P<0.05)。这些结果表明,河流弧菌能够在牙鲆粘液,尤其是鳃粘液中生长和定植,有利于其进一步感染、致病。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)细菌败血感染症及病原检验与分析

采用调查统计、剖检病变、病原分离鉴定与人工感染健康鱼致病作用试验的方法 ,对自然发生的养殖牙鲆细菌败血感染症病例 ,进行了发病情况、临床表现及病理变化等方面的检验 ,同时取病 (死 )牙鲆的肝、腹水、腐烂肌肉组织为材料进行细菌分离 ,对分离于 1 0尾鱼 2 0株纯培养菌的形态特征、理化特性等进行鉴定。结果表明 ,分离出来的两种细菌 ,一种是弧菌属(VibrioPacini 1 85 4 )细菌的一个新种 (sp .nov .)并定名为牙鲆弧菌 (Vibrioolivaceussp .nov .) ;另一种是气单胞菌属 (AeromonasKluyverandvanNiel 1 936)的嗜水气单胞菌 (A .hydrophila)。通过人工感染试验等表明该两种分离菌为相应感染症的致病菌。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒的分离

通过不同的样品处理和离心方法 ,发现了影响淋巴囊肿病毒 (LCDV)得率和纯度的因子 ,通过消除该因子并结合计算机软件设计程序 ,建立了高纯度LCDV的快速分离技术。

ISSR标记在牙鲆(Paralichthys olivaceus)与石鲽(Kareius bicoloratus)种间杂交一代的分离方式分析

利用ISSR标记对牙鲆♀与石鲽♂单对杂交亲本及其子一代(全同胞家系)的分离方式进行了研究。结果表明,8个ISSR引物共扩增出181个标记,其中116个为多态性,占总数的64.09%;标记在F1代呈三种分离方式:符合孟德尔分离比例、偏离孟德尔分离比例和异常分离。符合孟德尔分离比例的情况包括:不分离(代表了亲本基因型的5种组合:AA×AA、AA×Aa、Aa×AA、AA×aa、aa×AA);1︰1分离(代表了亲本基因型的2种组合:Aa×aa、aa×Aa);3︰1分离(代表了亲本基因型的1种组合:Aa×Aa)。偏分离的标记包括:亲本中呈多态而在子代中偏离1︰1分离的标记和亲本均有而在子代中偏离3︰1分离的标记。异常分离的标记包括:F1代出现双亲均不具备的标记和双亲或单亲有而子代却无的标记。3种分离位点出现的频率和数量分别为:82.87%、150,11.05%、20,6.08%、11;双亲共有标记中85.33%的不发生分离,单亲特有标记中28.57%—35.85%发生正常分离,该研究结果可为进一步利用该群体构建牙鲆和石鲽遗传连锁图谱奠定良好的工作基础并提供一定的理论依据。

牙鲆(Paralichthysolivaceus)仔稚幼鱼肠道菌群结构比较分析

采用MiSeq 16S rRNA高通量测序技术和生物信息学分析方法,构建了牙鲆(Paralichthys olivaceus)工厂化人工育苗模式下仔稚幼鱼阶段6个不同发育时期18个样品的16S rRNA基因测序文库,共获得7462个OTU(Operational Taxonomic Unit),分类为42个菌门972个菌属。对肠道菌群的形成过程及结构多样性变化分析显示,牙鲆初孵仔鱼的菌群组成多样性丰富,体内的优势菌为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes);在9日龄和21日龄摄食轮虫(Rotifer)和卤虫(Artemia sp.)幼体样品中,肠道的优势菌群结构较单一,变形菌门成为此时期肠道的优势菌群;45日龄摄食配合饲料后,肠道中变形菌门的相对丰度显著降低,厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度明显增大,成为肠道菌群的优势菌群。在属水平的菌群结构中发现,牙鲆仔稚幼鱼肠道优势菌群的种类和数量都发生了较大变化,在9日龄和21日龄时期肠道中弧菌属(Vibrio)相对丰度最高,到45日龄后相对丰度锐减到最低水平;拟杆菌属(Bacteroides)和普氏菌属(Prevotella)在80日龄后达到较高水平,成为肠道优势菌属;厚壁菌门的8个菌属在80–115日龄时期均发展成为优势菌属,定植于牙鲆的肠道。本研究揭示了工厂化人工育苗模式下牙鲆仔稚幼鱼肠道菌群结构及演替规律。

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)受精卵及仔稚鱼生理生态学研究进展

作者综述近年来国内外在褐牙鲆受精卵及仔稚鱼的发育、行为及理化环境对其生理生态的影响等方面的研究进展。着重介绍在人工养殖环境中 ,水温、盐度、水质、光照等环境因素的变化对褐牙鲆卵的孵化及仔稚鱼的发育和行为所产生的影响 ,以及褐牙鲆仔稚鱼不同发育阶段对各种理化环境的耐受范围和阈值。探讨人工种苗和天然种苗在形态发育及行为等方面的差异 ,对今后褐牙鲆的集约化健康养殖提出了几点建议。

秦皇岛近海增殖放流区牙鲆(Paralichthys olivaceus)回捕群体的遗传多样性分析

本研究利用12对微卫星标记对秦皇岛近海增殖放流区内的牙鲆(Paralichthys olivaceus)回捕群体的遗传多样性进行分析,并与放流用牙鲆亲本群体和放流前群体的遗传多样性进行对比。结果显示,在3个群体中,等位基因数(N_a)为11.917–22.167个,平均观测杂合度(H_o)为0.800–0.836,平均期望杂合度(H_e)为0.814–0.845,平均多态信息含量(PIC)为0.775–0.818。其中,回捕群体的平均N_a最多,为22.167,放流前群体的平均N_a最少,为11.917。平均H_o最大的是回捕群体(0.836),最小的是放流前群体(0.800)。平均H_e最大的是亲本群体(0.845),最小的是放流前群体(0.814)。在36个群体–位点组合中,有23个群体–位点组合显著偏离哈迪-温伯格平衡状态(P<0.05)。3个群体的基因分化系数G_(st)值为0.005–0.043,遗传分化均为较弱。研究表明,3个群体均保持较高的遗传多样性,放流人工培育苗种对回捕群体的遗传多样性和遗传结构未产生明显的影响。

实验微粒饲料中花生四烯酸含量对牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚鱼生长、存活的影响

采用花生四烯酸即廿碳四烯酸(AA,20∶4n-6)含量梯度法,制备了四种n-3HUFA含量相等、DHA/EPA比例相同、AA含量分别为0.06%、1.00%、1.5%、2.0%的实验微粒饲料,进行了AA的不同含量对牙鲆仔稚鱼生长、存活、体内相关成分以及对外部压力耐受性的影响研究。26天的养殖试验结果表明,当牙鲆仔稚鱼实验微粒饲料中AA的含量为1.5%时,牙鲆仔稚鱼的生长、存活以及对不同压力的耐受性都达到最佳。养殖试验结束后,对稚鱼体内相关成分的分析结果表明,稚鱼体内AA的含量随着实验微粒饲料中AA含量的增加而增加。

静水压力诱导牙鲆(Paralichthys olivaceus)四倍体的条件优化

采用静水压力抑制受精卵第一次卵裂的方法,进行了诱导牙鲆四倍体的研究。结果表明,将受精卵保持在(15.5±0.5)℃,从受精后70min开始用55MPa的压力处理6min后,正常仔鱼孵化率最高达到15.6%,此时的四倍体诱导率也最高达到63.3%。利用获得的最佳诱导条件处理获得了数千尾体长8—15cm的幼鱼,流式细胞仪检测和红血球长径测量结果显示,处理组幼鱼中四倍体约占13.3%,说明四倍体培育成功。该成果为开展牙鲆多倍体育种奠定了基础。