氰戊菊酯对牙鲆鳃细胞系体外的细胞毒性

采用牙鲆鳃细胞系FG-9307,测定拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯的体外细胞毒性.细胞生长速度在测试质量浓度5,10和15μg/mL显著降低.此外,三种应用比较广泛的测试终点方法——中性红吸收实验法、四唑盐比色实验法、细胞蛋白分析法被用于检测氰戊菊酯的体外细胞毒性.实验证明三种测试方法的细胞毒性的相关性很高,并不因测试终点不同而不同.这说明FG细胞系有可能成为检测氰戊菊酯体外细胞毒性的合适的生物指标.

鱼类淋巴囊肿病毒感染牙鲆鳃细胞系的研究

以患病牙鲆的囊肿组织为试验材料,冰浴匀浆后采用低速离心的方法提取淋巴囊肿病毒,用粗提的病毒液感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,同时应用以抗淋巴囊肿病毒单克隆抗体为第一抗体的间接免疫荧光抗体技术检测淋巴囊肿病毒是否感染了牙鲆鳃细胞并在其中增殖。结果发现生长旺盛的单层牙鲆鳃细胞接种淋巴囊肿病毒2天后出现明显的细胞病变效应,形成空斑,应用间接免疫荧光抗体方法检测结果为抗淋巴囊肿病毒单抗与未接种淋巴囊肿病毒的牙鲆鳃细胞呈阴性反应,而接种病毒的牙鲆鳃细胞,细胞质中有明显的特异性荧光,该结果说明牙鲆鳃细胞系是淋巴囊肿病毒的敏感细胞系。

利用牙鲆和牙鲆鳃细胞(FG)检测除草剂丁草胺的急性毒性和遗传毒性

为科学评价丁草胺对牙鲆的毒性效应,本文采用生态毒理学方法研究丁草胺对牙鲆和体外培养的牙鲆鳃细胞(FG)的急性毒性以及对牙鲆血细胞的微核化和FG细胞的DNA的片断化诱导作用。结果表明:中性红(NR)吸收、MTT(四唑盐)检测和细胞蛋白含量分析测得丁草胺对FG细胞的24 h-IC_(50)分别是43.32、43.86和44.91μmol/L;低于10μmol/L的丁草胺对FG细胞没有毒性,20～80μmol/L的丁草胺对FG细胞的毒性表现为浓度依赖性;丁草胺对牙鲆的96 h-LC_(50)为6.55 nmol/L,约为体外培养FG细胞24 h-IC_(50)的1/7000;30μmol/L丁草胺处理FG细胞8 h后,FG细胞基因组DNA出现明显的片断化,并且随着处理时间的延长,DNA片断化越来越严重;1.28～3.84 nmol/L丁草胺处理牙鲆96 h后,牙鲆血细胞的微核率均明显升高。以上结果表明丁草胺对牙鲆高毒并且具有遗传毒性。

牙鲆NOD2基因的表达分析及在抗迟缓爱德华氏菌感染过程中的功能

本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库预测得到牙鲆NOD2基因(PoNOD2),并利用PCR技术进行序列验证。同时,设计迟缓爱德华氏菌注射感染牙鲆成鱼和体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验,探究PoNOD2基因在抗菌免疫反应中的作用。PoNOD2基因的开放阅读框长度为2964 bp,编码988个氨基酸。PoNOD2蛋白有3种保守结构域,包括C-末端LRR,中心NACHT和N-末端CARD结构域。实时荧光定量PCR结果显示,在所检测牙鲆组织中,迟缓爱德华氏菌的侵染能显著上调PoNOD2的表达。体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验显示,在PGN、PolyⅠ:C和迟缓爱德华氏菌刺激下,PoNOD2表达上调。亚细胞定位显示,PoNOD2蛋白定位于牙鲆鳃细胞的细胞质中。在迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞过程中,PoNOD2基因的过表达能够抑制细菌生长,并引起IL-1β、IL-6和IL-8等炎性细胞因子的表达上调。结果表明,PoNOD2在抑制迟缓爱德华氏菌生长以及调节牙鲆对病原菌的免疫应答中发挥重要作用。

免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度

利用免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度。以牙鲆鳃细胞系(FG)作为感染细胞,将生长旺盛的FG细胞接种于48孔培养板中培养至形成细胞单层,用2倍连续稀释的LCDV粗提液分别接种FG细胞。固定各稀释度LCDV感染后的FG细胞,孵育抗牙鲆LCDV单克隆抗体,其后再运用生物素-亲合素反应系统,以碱性磷酸酶底物AP-Red试剂盒发色。倒置显微镜观察,被病毒感染的FG细胞的细胞质呈现红色,未被感染细胞的细胞质呈无色。记录各稀释度病毒感染的阳性细胞孔数,按Reed-Muench法计算组织细胞培养半数感染量(TCID50)。结果显示,免疫细胞化学法测得LCDV在FG的滴度为1.77×210 TCID50/mL。该法可以用来有效测定LCDV滴度,且结果直观、准确性较好,灵敏度较高。

大菱鲆红体病虹彩病毒体外增殖条件的研究

探讨大菱鲆病毒疫苗的研制,以牙鲆鳃细胞(FG细胞)为增殖体系,利用细胞病变效应(CPE)为判断指标,对大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)的体外最适增殖条件等进行了研究。结果表明,病毒接种量、病毒吸附时间、细胞培养条件对TRBIV的体外增殖均有明显的影响,以0.2 mL病毒液接种FG细胞、吸附2 h、用含10%胎牛血清的MEM培养液于22℃培养时,病毒的增殖速度最快。研究还发现,病毒的收获时间和病毒液冻融次数对所得病毒的感染力均有显著影响,在最佳增殖条件下,病毒在FG细胞中增殖至第4天时进行收获,且只冻融1次,其感染活性最强,反复冻融后病毒的感染活性会显著降低。