人源α-烯醇化酶B细胞表位鉴定及其与牙龈卟啉单胞菌烯醇化酶的交叉反应预测

目的:预测鉴定人源α-烯醇化酶蛋白的B细胞抗原表位,探讨人源α-烯醇化酶与牙龈卟啉单胞菌烯醇化酶之间的交叉反应性。方法:以人源α-烯醇化酶蛋白序列为基础,综合应用多个软件预测B细胞线性表位;再以人源α-烯醇化酶的蛋白晶体结构为基础,采用4个生物信息学软件综合预测B细胞构象表位;利用原核表达系统对人源α-烯醇化酶蛋白进行表达、亲和层析法进行,纯化抗原免疫BALB/c小鼠,化学合成预测的线性表位片段检测抗体反应,确定人源α-烯醇化酶蛋白B细胞表位。利用Clustal X进行蛋白质序列比对和Swiss-Model进行同源模建,研究人源α-烯醇化酶和牙龈卟啉单胞菌烯醇化酶的交叉反应性。结果:人源α-烯醇化酶线性B细胞表位优势区域为9-25aa,28-43aa,70-85aa,163-178aa,229-244aa,280-295aa;构象性B细胞表位优势区域为:1-4/24-30/77-86/124aa,9-16/51-59aa,250-254/262-268/271-274aa;合成的线性表位片段中9-25aa免疫应答反应最强烈,其次是70-85aa,再次为28-43aa,163-178aa,229-244aa,280-295aa;牙龈卟啉单胞菌烯醇化酶和人源α-烯醇化酶氨基酸序列同源性高达50.11%,两者在线性B细胞表位优势区域的9-24aa和32-42aa序列高度相似;空间构象比对结果显示牙龈卟啉单胞菌烯醇化酶和人源α-烯醇化酶之间的RMSD值为1.055,且两者在3个构象性B细胞表位优势区域的空间构象高度相似,推测二者可能在上述区域发生交叉反应。结论:预测并鉴定了人源α-烯醇化酶蛋白的B细胞抗原表位,比较其与牙龈卟啉单胞菌的烯醇化酶可能发生交叉反应的位点,为研究人源α-烯醇化酶蛋白的自身抗原性和类风湿性关节炎发病机制提供了理论基础。

基于YTHDF2介导凋亡相关因子降解途径研究牙龈卟啉单胞菌协助食管癌免疫逃逸

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)感染食管癌细胞后对YTHDF2及凋亡相关因子(Fas)的影响,阐明其促进免疫逃逸可能的调控机制。方法 运用免疫组织化学法及Western blot法检测Pg感染食管癌与YTHDF2及Fas表达变化;运用免疫共沉淀验证YTHDF2和Fas蛋白间的相互作用;将体外培养的Pg感染后的KYSE150细胞通过慢病毒转染分为对照组(转染si-NC)和实验组(转染si-YTHDF2),Western blotting检测两组细胞中YTHDF2、组织蛋白酶B(CTSB)及Fas、FasL蛋白的表达水平;对Pg感染的KYSE150细胞用组织蛋白酶抑制剂(E64)进行处理,Western blotting分别检测抑制剂处理前后YTHDF2、CTSB、Fas及FasL蛋白的表达变化情况;Pg感染前后及E64处理的KYSE150细胞与人外周血单个核细胞(PBMC)共培养,运用流式细胞术检测T细胞相关效应分子的表达情况。结果 免疫组化法及Western blotting结果显示,Pg感染后的组织或细胞中YTHDF2的表达增强,而Fas表达减弱(P<0.001);免疫共沉淀结果显示,YTHDF2和Fas之间可直接相互作用;Western blotting结果显示,si-YTHDF2组细胞中CTSB表达量减低,而Fas及FasL的表达量高于si-NC组(P<0.001);用E64处理细胞后,CTSB表达减弱,YTHDF2表达无影响,而Fas及FasL的表达增强;流式细胞术结果显示,与PBMC共培养的细胞中,GranzymeB及Ki67表达由强到弱分别为Pg阴性、Pg阳性+E64、Pg阳性,而PD-1表达情况相反(P<0.001)。结论 Pg感染依赖YTHDF2调节Fas的表达,协助食管癌免疫逃逸,从而促进食管癌发生发展,表明YTHDF2可能是一个新的调控食管癌免疫逃逸的关键分子。

牙龈卟啉单胞菌脂多糖促进人牙周膜干细胞组蛋白甲基化转移酶PRDM9的表达研究

目的研究牙龈卟啉单胞菌(Pg)脂多糖(LPS)对牙周膜间充质干细胞(PDLSCs)组蛋白甲基化转移酶PRDM9的作用及调控机制。方法选择不同浓度的Pg. LPS处理PDLSCs;利用实时定量RT-PCR的方法检测多种组蛋白甲基化转移酶在mRNA水平的表达变化;此外在Pg. LPS处理细胞的同时加入0.5μg/ml TLR4中和抗体,比较阻断及未阻断情况下筛选出的差异基因在mRNA水平的表达变化。结果实时定量RT-PCR结果显示PDLSCs在10μg/ml Pg. LPS刺激24 h和48 h后,组蛋白甲基化转移酶PRDM9基因表达量显著升高,具有时间相关性。选用1、5和10μg/ml的Pg. LPS处理PDLSCs,48h后检测到PRDM9表达量升高与Pg. LPS呈剂量相关性;与对照组相比阻断TLR4信号通路使得PRDM9的表达量明显下调。结论 Pg. LPS能够激活TLR4信号通路进而促进组蛋白甲基化转移酶PRDM9基因的表达。

牙龈卟啉单胞菌对感染流感病毒肺上皮细胞一氧化氮合酶的影响

目的观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)对感染流感病毒(H1N1)肺上皮细胞一氧化氮合酶的影响,以期为探讨牙周病在肺疾病发病机制中的作用提供临床依据。方法利用不同MOI值P.gingivalis与MOI值为2的H1N1共同感染于肺上皮细胞,未感染的细胞作为阴性对照。利用硝酸还原酶法测定上清液中NO的浓度;Westernblot检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)表达水平。结果各组细胞在4 h、8 h、12 h、24 h内NO生成均有增加。4 h、8 h、12 h、24 h后E组NO的量分别为41.404±3.079、78.945±3.001、592.983±1.690、2360.660±4.199μmol/L,8 h、12 h、24 h与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。12 h、24 h P.gingivalis促进H1N1感染的肺上皮细胞i NOS蛋白水平的表达,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。结论 P.gingivalis与H1N1共同作用于肺上皮细胞能够促进i NOS的表达,最终促进NO的生成。

牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Ltp1的表达、纯化及酶学性质研究

采用重组法构建Ltp1的原核表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导过表达,然后用镍柱层析法粗纯化,分子筛细纯化得到目的蛋白,以SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达产物;将目的蛋白和底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性。SDS-PAGE结果显示有与目的蛋白理论相对分子质量一致的表达条带;Western blot分析证实该蛋白带有6个组氨酸(His)标签的目的蛋白,能够催化磷酸单酯的活性;计算出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为70.4μmol、51.1μmol/(L·min),pH 5.0~6.0催化活性最高,在37~50℃具有较高活性。

龈下菌斑及冠状动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌的同源性检测

目的:检测牙周袋内牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌(P.g)与冠状动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌的同源性,探讨慢性牙周炎发生发展与冠心病的相关性。方法:选取15例患有冠状动脉粥样硬化型心脏病伴有慢性牙周炎的患者,分别收集其龈下菌斑样本和冠状动脉粥样硬化斑块样本,提取细菌DNA,PCR检测样本中的P.g16S rDNA基因,扩增产物行基因序列的测定。结果:龈下菌斑中的P.g16S rDNA基因与冠状动脉粥样硬化斑块中的P.g16S rDNA基因具有高度同源性。结论:牙周致病菌与冠心病发生发展密切相关,慢性牙周炎是冠心病的危险因素之一,为冠心病及慢性牙周炎的防治提供了依据。

成人正畸患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化

目的研究成人正畸患者在固定矫治器戴入后,其牙周临床指标和龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的早期变化。方法选择成人正畸患者11例,分别在矫治器戴入前,戴入后第1、3个月检查牙周临床指标(包括菌斑指数、龈沟出血指数、探诊深度和附着丧失),同时采集龈下菌斑样本,利用荧光实时定量聚合酶链反应检测样本中P.gingivalis和总细菌的数量,计算出P.gingivalis的检出率和构成比。分析牙周临床指标和P.gingivalis的检出率、构成比在不同观察时点的变化情况。结果菌斑指数、龈沟出血指数在矫治器戴入后均比戴入前明显升高(P<0.05)。探诊深度在矫治器戴入1个月后升高(P<0.05),3个月后下降至基线水平。试验中未发现有探诊深度大于2mm的患者,也未发现有附着丧失的患者。在3次检测中,P.gingivalis检出率均为45.5%,而P.gingivalis构成比的变化也无统计学差异(P>0.05)。结论固定矫治器戴入早期可引发成人正畸患者口内局部菌斑堆积,菌群中P.gingivalis增殖,出现轻度牙龈炎。

群体感应抑制剂溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成影响的研究

目的研究群体感应抑制剂溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响。方法采用二倍稀释法,确定溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。含无水乙醇的牙龈卟啉单胞菌菌悬液作为阴性对照组,牙龈卟啉单胞菌菌悬液为空白对照组,通过光密度值测定和扫描电镜观察,研究1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC等不同浓度溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响。结果不同实验浓度的溴化呋喃酮均可抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成。随着溴化呋喃酮浓度增加,牙龈卟啉单胞菌菌悬液的光密度值逐渐减小。1/4MIC组、1/2MIC组和MIC组形成的生物膜结构疏松,2MIC组仅见散在的牙龈卟啉单胞菌菌体,未见生物膜结构形成。结论溴化呋喃酮在不影响细菌生长的情况下,能抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成。溴化呋喃酮的应用可能为牙周病的抗菌治疗提供一条新的途径。

五倍子对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的抑制作用

目的 :观察五倍子水提取物对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的影响。方法 :通过应用荧光分光光度计检测荧光底物的降解测定酶活力。结果 :浓度 0 .5g/L～ 1g/L的五倍子可以抑制 5 0 %的底物降解 ,4 g/L的五倍子可抑制超过 90 %的底物降解。 结论 :五倍子水提取物可有效抑制牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性 ,其抑制作用可能会降低细菌生长及其毒力 。

骨碎补对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性的抑制作用

目的:观察骨碎补水提物对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性的影响。方法:通过利用荧光分光光度计检测荧光底物的降解来测定酶活力。结果:骨碎补各浓度均可不同程度抑制Pg产生的胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性,终浓度为1.2g/L的骨碎补液可抑制50%的TLP活性,而终浓度为1.3g/L的骨碎补液可抑制50%的糖苷酶活性。结论:骨碎补水提物能有效抑制牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶的活性。

牙龈卟啉单胞菌与牙周病相关性的聚合酶链反应研究

目的利用PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)的16SrDNA水平,通过检测该基因水平来探讨牙龈卟啉单胞菌的水平与牙周病的相关性。方法采集慢性牙周炎患者12例共36个龈下菌斑标本,记录临床指标(探诊深度、临床附着水平、牙龈指数、菌斑指数、龈沟出血指数),PCR检测龈下菌斑标本中的P.g16SrDNA基因,扩增产物经琼脂糖电泳、拍照后,应用计算机软件GeneTools扫描并计量其中的相对核酸含量。结果P.g16SrDNA水平与探诊深度(P<0.001)及牙龈指数(P<0.01)之间存在正相关关系。结论P.g16SrDNA水平与牙周状态密切相关,对于P.g16SrDNA水平的监测有望成为牙周病诊断和治疗方案制定的辅助检查手段。

牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达。方法利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH。克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果核酸序列测定与分析表明:表达重组子pET-32a-GAPDH与NCBI核酸数据库中收录的GAPDH序列同源性达99.802%;在最佳浓度的IPTG诱导下,GAPDH可高效表达。结论本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中表达了GAPDH蛋白,为后续实验研究GAPDH的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。

牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达

目的:构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子,转化于大肠杆菌BL21中,并在最适宜条件下诱导表达。方法:以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基因组DNA为模板,利用PCR技术获得目的基因PAD,将扩增得到的PAD基因定向插入线性克隆载体PMD18-T Vector中,得到克隆重组子PMD18-T-PAD。经PCR和双酶切鉴定正确的克隆重组子PMD18-T-PAD与表达载体PET-28a经Xhol和Ncol双酶切后,在一定连接体系下,连接构建表达质粒PET-28a-PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒PET-28a-PAD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋白。以抗His Tag单克隆抗体为一抗,Western免疫印迹鉴定。结果:DNA测序结果表明,PAD与NCBI核酸数据库中收录的PAD序列同源性达100%;37℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,250r/min振摇培养6h的诱导条件下,PAD可高效表达。结论:本实验成功构建了PAD的克隆表达重组子,并在大肠杆菌中表达了PAD蛋白,为进一步研究PAD的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。

多聚酶链反应检测牙周病人及其家庭成员中的牙龈卟啉单胞菌

近年来随着分子生物学的发展 ,发现作为牙周主要致病菌的牙龈卟啉单胞菌与其它产黑菌之间无同源性、证实其有特异性。作者根据牙龈卟啉单胞菌特定的纤毛亚单位蛋白结构基因 ,设计一对寡核苷酸引物 ,采用多聚酶链反应简称 PCR扩增了 131b P特异片段 ,实验表明 ,PCR直接检测临床标本中的牙龈卟啉单胞菌 ,不仅特异、敏感 ,而且快速 ,从而显示了较好的优越性。同时 ,作者也证实该引物具有高度的特异性 ,可用此对引物检测口腔中的牙龈卟啉单胞菌。本文作者继续用该引物 ,分析牙龈卟啉单胞菌在牙周炎患者家庭成员中的传递。经 PCR检测 10名牙周炎患者 ,有 8名牙龈卟啉单胞菌为阳性 ;配偶有 6名为阳性 ;6对牙龈卟啉单胞菌均为阳性的夫妇中 ,有两个家庭的子女为阳性 ,年龄最大 11岁 ,最小 6岁 ,证明牙龈卟啉单胞菌可能在家庭中传播 ,其途径可能是口接触或唾液接触。并发现以上 6名患者的配偶 ,有不同程度的牙周损害。本实验认为

食管鳞癌中牙龈卟啉单胞菌通过14-3-3σ调控程序性死亡-配体1蛋白降解

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是口腔疾病的重要致病菌之一,与人食管鳞癌(ESCC)进展密切相关。然而P.gingivalis促进ESCC发生发展的分子机制尚不十分清楚。该研究探讨了ESCC中P.gingivalis通过诱导程序性死亡-配体1(PD-L1)蛋白表达上调的分子机制。Western印迹和RT-PCR结果显示,KYSE140和KYSE150细胞中14-3-3σ与PD-L1的蛋白质表达呈负相关,但二者的mRNA表达无相关性。免疫共沉淀结果表明,14-3-3σ蛋白通过与PD-L1蛋白结合,促进PD-L1的泛素化降解,P.gingivalis感染干预了14-3-3σ与PD-L1蛋白质复合体形成;KYSE140和KYSE150细胞中14-3-3σ沉默,降低了PD-L1泛素化介导的蛋白质酶体降解,14-3-3σ过表达明显抑制P.gingivalis诱导的PD-L1蛋白表达上调。免疫组化结果进一步证实,在ESCC组织中P.gingivalis丰度与14-3-3σ蛋白表达呈负相关,与PD-L1蛋白表达呈正相关,14-3-3σ与PD-L1的蛋白质表达呈负相关。综上所述,ESCC中P.gingivalis通过下调14-3-3σ蛋白表达,降低14-3-3σ介导的PD-L1蛋白的泛素-蛋白质酶体降解途径,进而抑制抗肿瘤免疫,促进ESCC恶性演进。

不同合金烤瓷冠修复后龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化

目的:研究使用不同合金烤瓷冠修复后龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化。方法:选择门诊患者行下颌第一磨牙全冠修复共60例,随机分入两组不同合金烤瓷冠组,分别在戴入前,戴入后1个月、3个月检查龈沟出血指数,并且采用荧光定量聚合酶链反应测定龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化。结果:比较修复前,钯银合金组的龈沟出血指数在修复后1个月、3个月无明显升高(P>0.05);而钴铬合金组的龈沟出血指数在修复后1个月、3个月有较明显升高(P<0.05);与修复前比较,钯银合金组的牙龈卟啉单胞菌相对定量值在修复后1、3个月无明显增加(P>0.05);钴铬合金组在修复后1个月、3个月的牙龈卟啉单胞菌相对定量值有明显增加(P<0.05)。结论:两种合金材料的烤瓷冠修复后对患者牙龈有一定的影响;其中钴铬合金影响明显大于钯银合金。

乳铁蛋白对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的影响

目的:探讨乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)胰酶样蛋白酶(TLP)活性的影响。方法:在BHI培养基中加入不同浓度的乳铁蛋白和一定浊度的P.g进行厌氧培养。测定培养物上清液和菌细胞上清液中TLP活性及蛋白质含量,计算TLP的比活。结果:乳铁蛋白对P.g结合态TLP活性有明显的抑制作用,高浓度的牛乳铁蛋白对P.g游离态TLP活性有明显抑制作用,但低浓度的牛乳铁蛋白对其抑制不明显。结论:乳铁蛋白抑制P.g TLP的活性,提示其对牙周病可能具有防治作用。

野菊花提取物对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的抑制作用

目的:探讨野菊花提取物对牙龈卟啉单胞菌(P.g)胰酶样蛋白酶(TLP)活性的影响,为野菊花治疗牙周炎提供理论依据。方法:配制牛心脑浸液培养基(BHI),低、中、高浓度对倍稀释的野菊花提取物(0.1563、0.3125和0.6250g·L-1)和一定浊度的P.g菌悬液,实验分为低、中、高浓度野菊花提取物组、阳性对照组(不加野菊花提取物)和阴性对照组(加入低浓度野菊花提取物,不加P.g)。各组含溶液的EP管在37℃恒温条件下厌氧培养48h,测定培养物上清液和菌细胞破碎后上清液中TLP活性和蛋白水平,计算TLP比活。结果:与阳性对照组比较,中、高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性(游离态和结合态)均降低(P<0.05);与低浓度野菊花提取物组比较,中、高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性(游离态和结合态)均降低(P<0.05);与中浓度野菊花提取物组比较,高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性(游离态和结合态)降低(P<0.05),各组上清液中蛋白水平和TLP比活无明显变化(P<0.05)。结论:野菊花提取物对TLP活性有抑制作用。

牙龈卟啉单胞菌促进人脐静脉内皮细胞一氧化氮的生成

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(humanu mbilical vein endothelial cells,HUVEC)一氧化氮(NO)生成的影响,探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化发病机制中的作用提供依据。方法:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10、1∶100Pg干预HUVEC,未受Pg干预的HUVEC作为阴性对照组,分别于4、8、12、24h时收集细胞上清液,利用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度;Western-blot检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达水平;透射电镜观察Pg对HUVEC的黏附和入侵方式。结果:在24h内,PgMOI1∶10、1∶100能促进HUVECNO的生成,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),PgMOI1∶10,MOI1∶100可以诱导HUVECiNOS的蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),透射电镜观察Pg能够利用其菌毛黏附于HUVEC细胞表面并入侵到HUVEC细胞胞质内,定植于细胞内。结论:Pg能够黏附于HUVEC并入侵到细胞胞质内,诱导iNOS蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,最终促进HUVECNO的生成。过量的NO可能发挥细胞毒性作用,导致内皮功能失调。

多聚酶链反应检测牙龈卟啉单胞菌

近年来,随着 Pg 菌分子生物学研究工作的深入,已有 Pg 菌纤毛基因得以分离并测序。本文根据 Pg 菌特异的纤毛亚单位旦白结构基因设计寡核苷酸引物,采用 PCR 技术扩增了其中131bp 的片段,并对其进行特异性鉴定。结果表明:所用引物能对2株 Pg 菌参考菌株以及临床分离的20株 Pg 菌中扩出了大小一致的特异 DNA 片段,不能从其它14株异种菌中扩增出产物,故具有高度的特异性,其检测的敏感性为1Pg,大约10～100个细菌,为PCR 应用于口腔致病菌的检测奠定了基础。