牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Ltp1的表达、纯化及酶学性质研究

采用重组法构建Ltp1的原核表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导过表达,然后用镍柱层析法粗纯化,分子筛细纯化得到目的蛋白,以SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达产物;将目的蛋白和底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性。SDS-PAGE结果显示有与目的蛋白理论相对分子质量一致的表达条带;Western blot分析证实该蛋白带有6个组氨酸(His)标签的目的蛋白,能够催化磷酸单酯的活性;计算出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为70.4μmol、51.1μmol/(L·min),pH 5.0~6.0催化活性最高,在37~50℃具有较高活性。

牙龈卟啉单胞菌通过其分泌的蛋白酶促进食管鳞癌的增殖和侵袭

验证牙龈卟啉单胞菌的促食管鳞癌作用,并探讨其主要毒力因子-蛋白酶Gingipains在致食管鳞癌生长中的作用机制。方法 动物实验建立野生型牙龈卟啉单胞菌诱导4-硝基喹啉N-氧化物(4-nitroquinolineN-oxide,4NQO)致balb/c小鼠食管癌模型,验证牙龈卟啉单胞菌能否协同4NQO诱导食管鳞癌的发生;体外水平建立野生型牙龈卟啉单胞菌或加入野生型牙龈卟啉单胞菌蛋白Gingipains(Rgp和Kgp)特异性抑制剂感染食管鳞癌Eca109、KYSE510细胞模型,通过MTT实验、平板克隆实验、流式细胞术及Transwell侵袭实验检测其对食管癌细胞生物学行为的影响。结果 体内水平,和对照组及4NQO组相比,4NQO联合牙龈卟啉单胞菌感染能够成功诱导建立小鼠食管鳞癌模型,产生肉眼更为明显的肿瘤包块,更大的肿瘤环食管直径值及体积大小,差异有统计学意义。体外水平,和对照组及加入蛋白酶Gingipains抑制剂组相比,牙龈卟啉单胞菌感染组够促进食管鳞癌Eca109、KYSE510细胞的增殖及侵袭,差异有统计学意义。结论 牙龈卟啉单胞菌通过其分泌的蛋白酶Gingipains,促进了食管鳞癌细胞的增殖和侵袭。

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激中性粒细胞产生基质金属蛋白酶8和9的比较

目的比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)刺激下人外周血中性粒细胞(PMNs)产生基质金属蛋白酶8、9(MMP-8、MMP-9)的差异。方法采用密度梯度离心分离法分离纯化培养PMNs,P.gingivalisATCC33277(ⅠfimA)、WCSP115(ⅡfimA)、WCSP1.5(ⅢfimA)、W83(ⅣfimA)、WCSP559(ⅣfimA)菌悬液与新鲜分离的PMNs悬液共孵育2h,于5min、30min、1h、2h收集上清液,用ELISA方法检测MMP-8、MMP-9的表达。结果不同fimA基因型P.gingivalis刺激PMNs产生MMP-8、MMP-9的能力都显著高于未受刺激组;ⅡfimA、ⅣfimA(W83)型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-8在速度及量上均高于ⅢfimA、ⅣfimA(WCSP559)型P.gingivalis;ⅠfimA、ⅡfimA、ⅣfimA(W83)型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-9能力高于ⅢfimA、ⅣfimA(WCSP559)型P.gingivalis。结论ⅡfimA、ⅣfimA型P.gingivalis的致病能力相对较强,提示P.gingivalis的毒力和致病性与fimA基因型存在相关性。

牙龈卟啉单胞菌及其牙龈蛋白酶K对青少年牙龈健康的影响

目的分析牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）及牙龈蛋白酶K（Kgp）对青少年牙龈健康的影响。方法收集12-17岁青少年牙龈正常组（50例）、牙龈炎症指数Ⅰ级组（25例）和牙龈炎症指数Ⅱ级组（32例）的3组龈沟液标本,应用16SrDNA PCR技术检测各样本中的P.gingivalis及Kgp。3组P.gingivalis和Kgp阳性检出率的比较采用χ2检验;P.gingivalis和Kgp的相对含量与牙龈炎症指数之间的关系采用Spearman相关分析。结果 P.gingivalis在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅰ级组、Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P〈0.01）,牙龈炎症指数Ⅰ级组与Ⅱ级组间差异具有统计学意义（P〈0.05）。Kgp在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅰ级组与牙龈正常组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,牙龈炎症指数Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P〈0.01）。P.gingivalis和Kgp的检出率随着牙龈炎症指数的增加而升高。结论 P.gingivalis和Kgp与青少年牙龈健康密切相关。

五倍子对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的抑制作用

目的 :观察五倍子水提取物对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的影响。方法 :通过应用荧光分光光度计检测荧光底物的降解测定酶活力。结果 :浓度 0 .5g/L～ 1g/L的五倍子可以抑制 5 0 %的底物降解 ,4 g/L的五倍子可抑制超过 90 %的底物降解。 结论 :五倍子水提取物可有效抑制牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性 ,其抑制作用可能会降低细菌生长及其毒力 。

骨碎补对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性的抑制作用

目的:观察骨碎补水提物对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性的影响。方法:通过利用荧光分光光度计检测荧光底物的降解来测定酶活力。结果:骨碎补各浓度均可不同程度抑制Pg产生的胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性,终浓度为1.2g/L的骨碎补液可抑制50%的TLP活性,而终浓度为1.3g/L的骨碎补液可抑制50%的糖苷酶活性。结论:骨碎补水提物能有效抑制牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶的活性。

牙龈卟啉单胞菌感染对牙龈上皮细胞中基质金属蛋白酶13表达的影响

目的通过体外建立牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)感染牙龈上皮细胞模型,探讨P.gingivalis W83、ATCC 33277感染牙龈上皮细胞后基质金属蛋白酶13(MMP-13)表达的变化。方法将P.gingivalis W83、ATCC 33277作用于牙龈上皮细胞6、12、24和48 h,采用ELISA检测上清液中MMP-13蛋白浓度变化,实时PCR检测MMP-13 mRNA相对含量变化。结果 P.gingivalis感染牙龈上皮细胞后,MMP-13蛋白和mRNA表达的总体趋势是随时间的延长表达水平逐渐增高。P.gingivalis感染牙龈上皮细胞6 h,P.gingivalis ATCC 33277感染组和W83感染组MMP-13蛋白表达水平与对照组相比无统计学差异,而MMP-13 mRNA的相对表达量高于对照组(P<0.05);感染24和48 h后,P.gingivalis ATCC 33277感染组和W83感染组MMP-13蛋白和mRNA的相对表达量均明显高于对照组(P<0.05),且P.gingivalis W83感染组MMP-13明显高于P.gingivalis ATCC 33277感染组(P<0.05)。结论 P.gingivalis能够促进牙龈上皮细胞分泌MMP-13,造成牙周组织破坏。P.gingivalis W83降解细胞外基质的能力高于P.gingivalis ATCC 33277,更利于细菌向深部组织扩散。

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

目的纯化牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域(KGPcd)融合蛋白并制备其多克隆抗体,为下一步的实验提供条件。方法 KGPcd蛋白与载体pET-16b中的His标签融合表达,用Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,复性后用Western blot检测。以重组、纯化的KGPcd蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用间接ELASA法检测抗体效价,Western Blot进行抗血清特异性试验。结果经亲和层析、复性得到纯化融合蛋白His-KGPcd,Western blot进一步证实纯化的蛋白为His-KGPcd融合蛋白。抗血清稀释达1:3200时,ELASA法仍有明显的抗原抗体反应,Western blot也进一步证实抗血清能够与KGPcd发生特异性反应,抗体仅特异识别目的蛋白。结论成功制备兔抗KGPcd多克隆抗体,为后续研究奠定基础。

ABC转运蛋白调控牙龈卟啉单胞菌致病力的研究进展

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)是在所有物种中均存在的庞大且高度保守的转运蛋白基因家族,可调控多种微生物的致病力,在微生物适应宿主环境和在对抗抗生素中发挥重要作用。牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)是牙周炎的重要致病菌,其致病力受到多种毒力因子调控。本文就ABC转运蛋白的结构和功能及其调控P.gingivalis致病力的研究进展作一综述。

牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K活性与青春期龈炎的临床相关性

目的:检测并比较青春期龈炎患者的龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K(Kgp)的活性,探讨Kgp在青春期龈炎中的临床意义。方法:受试对象为36例14～17岁青春期龈炎患者,检测并记录受检者的各牙周临床指标GI、SBI、PD的测值,取龈下菌斑进行P.gingivalis的分离培养,16S rRNA聚合酶链反应(PCR)法鉴定。将P.gingivalis临床分离株复苏,在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,用N-p-硝基苯胺乙酸盐分析Kgp的氨基酸溶解活性。采用SPSS11.0软件包,分泌蛋白与菌体蛋白的Kgp活性比较用t检验;Kgp活性与各牙周临床指标之间的相关关系用秩相关检验分析,P<0.05具有显著性差异。结果:青春期龈炎的P.gingivalis临床分离株的分泌蛋白中Kgp的活性高于菌体蛋白(P<0.01),Kgp的活性与GI、SBI、PD之间有正相关关系,统计学上有显著性差异(P<0.05)。结论:Kgp酶活性的高低与青春期龈炎的严重程度有关。

牙龈卟啉单胞菌类胰蛋白酶基因调控和表达

牙龈卟啉单胞菌与牙周炎、牙髓炎、根尖周炎的发生有关 ,其产生的类胰蛋白酶能入侵并破坏组织 ,逃避宿主防御功能。本文就类胰蛋白酶的种类、类胰蛋白酶基因的调控与表达的最新进展进行综述。

青春期龈炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K的表达

目的:检测并比较青春期龈炎的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K(Kgp)的表达强度,揭示Kgp与青春期龈炎之间可能存在的致病关系。方法:受试对象为14～17岁青春期龈炎患者36例,检测并记录受检者的各牙周指数GI、SBI和PD测值,取龈下菌斑进行P.gin-givalis的分离培养,16SrRNAPCR法鉴定。将P.gingivalis临床分离株于对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,用抗KgpN-末端IgG亚基的单克隆抗体进行Westernblot检测,采用SPSS11.0软件包,秩相关检验分析Kgp的表达强度与各牙周指数之间的相关关系。结果:青春期龈炎的P.gingivalis临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中,KgpN-末端IgG亚基的表达强度与各牙周指数数值的高低有正相关关系,统计学上有显著性差异(P<0.01)。结论:Kgp对青春期龈炎有一定的致病作用。

乳铁蛋白对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的影响

目的:探讨乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)胰酶样蛋白酶(TLP)活性的影响。方法:在BHI培养基中加入不同浓度的乳铁蛋白和一定浊度的P.g进行厌氧培养。测定培养物上清液和菌细胞上清液中TLP活性及蛋白质含量,计算TLP的比活。结果:乳铁蛋白对P.g结合态TLP活性有明显的抑制作用,高浓度的牛乳铁蛋白对P.g游离态TLP活性有明显抑制作用,但低浓度的牛乳铁蛋白对其抑制不明显。结论:乳铁蛋白抑制P.g TLP的活性,提示其对牙周病可能具有防治作用。

野菊花提取物对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的抑制作用

目的:探讨野菊花提取物对牙龈卟啉单胞菌(P.g)胰酶样蛋白酶(TLP)活性的影响,为野菊花治疗牙周炎提供理论依据。方法:配制牛心脑浸液培养基(BHI),低、中、高浓度对倍稀释的野菊花提取物(0.1563、0.3125和0.6250g·L-1)和一定浊度的P.g菌悬液,实验分为低、中、高浓度野菊花提取物组、阳性对照组(不加野菊花提取物)和阴性对照组(加入低浓度野菊花提取物,不加P.g)。各组含溶液的EP管在37℃恒温条件下厌氧培养48h,测定培养物上清液和菌细胞破碎后上清液中TLP活性和蛋白水平,计算TLP比活。结果:与阳性对照组比较,中、高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性(游离态和结合态)均降低(P<0.05);与低浓度野菊花提取物组比较,中、高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性(游离态和结合态)均降低(P<0.05);与中浓度野菊花提取物组比较,高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性(游离态和结合态)降低(P<0.05),各组上清液中蛋白水平和TLP比活无明显变化(P<0.05)。结论:野菊花提取物对TLP活性有抑制作用。

TRAF6/Runx2信号轴对牙龈卟啉单胞菌诱导血管平滑肌细胞钙化调控作用的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)/Runt-相关转录因子-2(Runt-related-transcription factor-2,Runx2)信号轴对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)诱导小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)钙化的调控作用。方法:用热灭活的P.gingivalis和VSMC共培养,在21 d时检测VSMC的钙化沉积和钙含量;并检测VSMC收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α),以及成骨标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OC)和Ⅰ型胶原A1(type I collagen A1,ColⅠA1)的基因和蛋白表达。此外,检测P.gingivalis诱导VSMC后TRAF6和Runx2的表达,进一步通过抑制TRAF6,检测其对Runx2表达以及VSMC和主动脉的钙化情况的作用。结果:P.gingivalis可促进VSMC发生钙化沉积以及钙含量增加(P<0.05);并且P.gingivalis能显著促进成骨标志物的表达,抑制VSMC收缩标志物表达(P<0.05);当抑制TRAF6表达时,能降低P.gingivalis诱导VMSC中Runx2的表达,并抑制VSMC和主动脉壁的钙化沉积,显著降低VSMC中钙含量(P<0.05)。结论:P.gingivalis促进VSMC成骨标志物表达,抑制收缩标志物表达,最终诱导VSMC发生钙化;并进一步证实P.gingivalis可通过TRAF6/Runx2信号轴调控VSMC和主动脉钙化。

牙龈卟啉单胞菌:从毒力因子到疫苗研发

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是革兰氏阴性口腔致病菌之一,其定植于牙龈内厌氧菌生物膜中,引起局部牙周炎。Pg由定植的牙龈局部通过体液扩散到全身引起多种疾病,如:心脑血管疾病、自身免疫性疾病、阿尔兹海默症、癌症等。药物难以到达牙龈部位且持续给药易引起菌体的耐药,不能达到根除的效果。因此,选择合适的抗原位点刺激机体免疫系统产生中和抗体是疫苗研究的关键。本文对Pg的致病及其机制进行了概括,并全面综述了相关的毒力因子,为清除和预防Pg感染提供靶标,同时从疫苗学角度评价和分析这些毒力因子作为疫苗的潜力。

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶的研究进展

牙周炎是一种牙齿支持组织的慢性炎症性疾病,能引起结缔组织和牙槽骨的破坏而导致渐进性附着丧失,最终可能导致牙齿脱落。革兰氏阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎的重要致病菌,具有包括脂多糖、菌毛、血细胞凝集素和胞外蛋白酶在内的多种毒力因子,其中牙龈蛋白酶提供的蛋白水解活性占该生物体产生的一般蛋白水解活性的大部分(85%),已被认为是必需的毒力因子。本文就牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶的分类、分泌、致病作用及其抑制剂的研究作一综述。

口腔干预措施对牙周炎大鼠颈动脉牙龈卟啉单胞菌检出量及C-反应蛋白表达的影响

目的建立慢性牙周炎(CP)合并高脂血症(HL)的SD大鼠模型并对其进行口腔干预,检测大鼠颈动脉局部C-反应蛋白(CRP)的表达情况及牙龈卟啉单胞菌的检出量,探讨牙周炎与动脉粥样硬化的相关性。方法 SD大鼠随机分为3组,A组为对照组,B组为HL组,C组为CP+HL组。C组分为C1组(不治疗组),C2组(基础治疗组),C3组(拔牙组);C2组又分为C2-1组(单纯牙周基础治疗组),C2-2组(牙周基础治疗+米诺环素+抗生素组);C3组又分为C3-1组(拔除患牙组),C3-2组(拔除患牙+抗生素组)。建模开始15周后随机处死B组大鼠1只,取颈动脉分叉血管组织进行油红O染色,观察到泡沫细胞形成则HL建模成功。建模成功后进行2次口腔干预,干预结束后5周处死所有大鼠,取双侧颈动脉血管分叉处组织,分别采用免疫组织化学法检测CRP相对含量,16s RNA半定量法检测样本中的牙龈卟啉单胞菌的相对含量。结果免疫组织化学结果显示,B、C组CRP阳性表达明显高于A组(P<0.05),与C1组相比,C组各干预组的CRP表达均降低(P<0.05),其中辅助抗生素组较不加抗生素组阳性表达更低(P<0.05),C2-2组在各干预组中阳性表达最低。牙龈卟啉单胞菌检测结果显示,C1组检出量最高,明显高于A、B组(P<0.05);C组各干预组的检出量均较C1组低(P<0.05),C3-2组最低(P<0.05)。结论伴HL的牙周炎大鼠不加干预任其发展,颈动脉血管中CRP的表达及牙龈卟啉单胞菌检出量都明显增加,血管病变逐渐加重。牙周基础治疗和拔牙均可有效降低颈动脉血管中CRP的表达及致病菌含量,其中牙周基础治疗对CRP表达的降低作用更明显,拔牙对降低牙周致病菌的作用更有效;基础治疗或拔牙时若辅以局部及全身抗炎药物,均可以有效提高CRP和牙周致病菌的降低作用。

牙龈卟啉单胞菌Gingipains对宿主细胞外膜蛋白的作用

牙龈卟啉单胞菌(Pg)是引起和加重牙龈炎的重要致病菌,Gingipains是Pg的细胞外半胱氨酸蛋白酶,是其最有效的毒力因子。Gingipains包括具有与赖氨酸特异结合活性的牙龈蛋白酶K(Kgp)和与精氨酸特异结合活性的牙龈蛋白酶R(Rgp),可以通过降解多种宿主外膜蛋白,帮助Pg逃避宿主的免疫反应,解除信号通路的调节,触发凋亡,最终导致组织破坏。对已发表数据的分析表明,Gingipains主要是通过在一个或多个位置分裂底物,或者通过降解外源性蛋白质和多肽而使其底物失活。