牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因真核表达载体的构建和体外表达

目的 :构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体 ,并检测其在体外真核细胞中的表达情况。方法 :利用基因重组技术构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因重组质粒pcDNA3.1( + ) -KGPcd ,然后通过脂质体将 pcDNA3.1( + ) -KGPcd瞬时转染COS7细胞 ,以RT -PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒的转录水平和蛋白表达情况。结果 :成功构建了牙龈蛋白酶K真核表达载体 ;转染的COS7细胞中可检测到目的蛋白的转录和表达。结论 :成功构建了 pcDNA3.1( + ) -KGPcd真核表达载体并在哺乳动物细胞中能够正确转录和表达 ,为下一步作为基因疫苗免疫动物提供了依据。

青少年正畸治疗早期牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K的变化研究

目的分析牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K在青少年正畸治疗早期的变化。方法随机收集青少年正畸牙龈正常者45例,分别取矫治器戴入前,戴入后1、2、3、6个月龈沟液标本,应用16S r DNA PCR技术检测各样本中的牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K;采用SPSS17.0软件包对数据进行统计分析,牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白K各组间检出率比较用χ2检验;牙龈卟啉单胞菌、牙龈蛋白K的检出率与牙龈炎症之间的关系用Spearman等级相关分析。结果牙龈卟啉单胞菌在矫治前与戴入后1个月有显著性差异(P<0.05),与2个月、3个月之间有极显著性差异(P<0.01);戴入后1个月与2个月之间有显著性差异(P<0.05);牙龈蛋白K在矫治器戴入前与戴入后1个月、6个月之间无显著性差异,与戴入后2个月、3个月之间有显著性差异(P<0.05);从第2个月开始牙龈卟啉单胞菌与牙龈蛋白K的检出率下降,到6个月时检出率已基本接近矫治器戴入前。结论青少年正畸治疗过程中在矫治器戴入早期可引发牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白K的增加,出现牙龈炎症反应,当增加到一定时间即2个月后开始逐渐下降,到6个月时已基本接近矫治器戴入前。

正畸治疗中牙龈蛋白K与牙龈炎性反应的关系

目的:分析牙龈蛋白K(gingipain K,Kgp)在正畸治疗中对牙龈炎性反应的影响。方法:选择青少年牙龈健康者45例,分别取矫治器戴入前与矫治器戴入后3个月的龈沟液,应用16S r DNA PCR技术检测各样本中的牙龈卟啉单胞菌(P.g)及Kgp,采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:矫治器戴入前Kgp检出率为35.71%,矫治器戴入后Kgp检出率为67.86%,两者之间差异显著(P<0.05)。结论:正畸治疗患者在矫治器戴入后Kgp检出率增加,出现牙龈炎性反应。

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白 。

牙龈卟啉单胞菌及其牙龈蛋白酶K对青少年牙龈健康的影响

目的分析牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）及牙龈蛋白酶K（Kgp）对青少年牙龈健康的影响。方法收集12-17岁青少年牙龈正常组（50例）、牙龈炎症指数Ⅰ级组（25例）和牙龈炎症指数Ⅱ级组（32例）的3组龈沟液标本,应用16SrDNA PCR技术检测各样本中的P.gingivalis及Kgp。3组P.gingivalis和Kgp阳性检出率的比较采用χ2检验;P.gingivalis和Kgp的相对含量与牙龈炎症指数之间的关系采用Spearman相关分析。结果 P.gingivalis在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅰ级组、Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P〈0.01）,牙龈炎症指数Ⅰ级组与Ⅱ级组间差异具有统计学意义（P〈0.05）。Kgp在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅰ级组与牙龈正常组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,牙龈炎症指数Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P〈0.01）。P.gingivalis和Kgp的检出率随着牙龈炎症指数的增加而升高。结论 P.gingivalis和Kgp与青少年牙龈健康密切相关。

牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中促凋亡蛋白Bad的表达改变

目的:检测牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中Bad的表达改变,为保护成骨细胞提供依据。方法:8.348U/L牙龈蛋白酶处理成骨细胞0、4、8、16、24、48和72h,或将不同浓度牙龈蛋白酶与成骨细胞作用24h后,蛋白质印迹法检测Bad蛋白表达改变。结果:在一定范围内,牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡中呈时间和剂量依赖性上调Bad的表达,牙龈蛋白酶抑制剂TLCK有效抑制牙龈蛋白酶所诱导的Bad的高表达。结论:牙龈蛋白酶上调Bad的表达,促凋亡蛋白Bad参与了牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程。

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

目的纯化牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域(KGPcd)融合蛋白并制备其多克隆抗体,为下一步的实验提供条件。方法 KGPcd蛋白与载体pET-16b中的His标签融合表达,用Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,复性后用Western blot检测。以重组、纯化的KGPcd蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用间接ELASA法检测抗体效价,Western Blot进行抗血清特异性试验。结果经亲和层析、复性得到纯化融合蛋白His-KGPcd,Western blot进一步证实纯化的蛋白为His-KGPcd融合蛋白。抗血清稀释达1:3200时,ELASA法仍有明显的抗原抗体反应,Western blot也进一步证实抗血清能够与KGPcd发生特异性反应,抗体仅特异识别目的蛋白。结论成功制备兔抗KGPcd多克隆抗体,为后续研究奠定基础。

牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K活性与青春期龈炎的临床相关性

目的:检测并比较青春期龈炎患者的龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K(Kgp)的活性,探讨Kgp在青春期龈炎中的临床意义。方法:受试对象为36例14～17岁青春期龈炎患者,检测并记录受检者的各牙周临床指标GI、SBI、PD的测值,取龈下菌斑进行P.gingivalis的分离培养,16S rRNA聚合酶链反应(PCR)法鉴定。将P.gingivalis临床分离株复苏,在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,用N-p-硝基苯胺乙酸盐分析Kgp的氨基酸溶解活性。采用SPSS11.0软件包,分泌蛋白与菌体蛋白的Kgp活性比较用t检验;Kgp活性与各牙周临床指标之间的相关关系用秩相关检验分析,P<0.05具有显著性差异。结果:青春期龈炎的P.gingivalis临床分离株的分泌蛋白中Kgp的活性高于菌体蛋白(P<0.01),Kgp的活性与GI、SBI、PD之间有正相关关系,统计学上有显著性差异(P<0.05)。结论:Kgp酶活性的高低与青春期龈炎的严重程度有关。

牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡中的作用及对Bim、整合素α5的影响

目的探讨牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡的作用及对与Bcl-2蛋白相互作用的细胞死亡调节子(Bim)蛋白、整合素ɑ5的影响。方法分离并提取牙龈蛋白酶,测定其活性,实验分为两组,其中实验组采用浓度为1.812 U/L的牙龈蛋白酶处理小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)48 h,对照组采用牙龈蛋白酶特异性抑制剂(TCLK)对牙龈蛋白酶进行预处理,采用TUNEL-DAPI法测定两组MC3T3-E1细胞的凋亡率,采用免疫印迹法测定不同时间两组Bim蛋白、整合素ɑ5表达变化。结果实验组牙龈蛋白酶中精氨酸牙龈蛋白酶(Rgp)、赖氨酸牙龈蛋白酶(Kgp)的活性均显著高于对照组(P<0.01);在0 h,两组MC3T3-E1细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),在第16、24、48 h实验组的MC3T3-E1细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.05);在第8、16、24、48 h实验组的Bim蛋白表达均显著高于本组0 h(P<0.05),在第24 h时达到最高值,同时也显著高于对照组(P<0.05);在第16、24、48 h实验组的整合素ɑ5表达较本组0 h均显著降低(P<0.05);同时显著低于对照组(P<0.05)。结论牙龈蛋白酶能成功诱导成骨细胞凋亡,这一作用机制可能与增强Bim蛋白表达、下调整合素ɑ5表达有关。

整合素在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制

目的探讨整合素α5、β1在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制。方法厌氧环境下培养牙龈卟啉单胞菌,分离牙龈蛋白酶。用6.840 U/L的牙龈蛋白酶处理人颅骨成骨细胞(HCO)48 h,生物素原位缺口末端标记法(TUNEL)-4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光双染色法检测细胞凋亡情况;Western印迹检测不同牙龈蛋白酶浓度和不同作用时间HCO中整合素a5、β1蛋白表达变化;用磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制剂LY294002处理HCO后观察不同时间点整合素a5、β1蛋白表达变化。结果 TUNEL-DAPI染色显示,牙龈蛋白酶作用48 h后阳性对照组及观察组HCO凋亡的细胞数目较空白对照组明显增多。与空白对照组相比,牙龈蛋白酶可明显下调HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平,且随浓度增加逐渐增强,各浓度之间差异有统计学意义(P<0.05)。随着牙龈蛋白酶作用时间延长,HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平逐渐下调,各时间点之间差异均有统计学意义(P<0.05);整合素β1蛋白表达水平降低程度明显大于整合素α5,牙龈蛋白酶作用16 h、24 h、48 h、72 h时整合素β1蛋白表达水平均明显低于同期整合素α5,差异有统计学意义(P<0.05)。LY294002处理HCO后,各时间点整合素α5、β1蛋白表达水平之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论牙龈蛋白酶通过PI3K-AKT信号通路下调整合素α5、β1表达来诱导人成骨细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性。

牙龈蛋白的生物学特性及临床意义

牙龈蛋白是一类结构和功能十分相似的蛋白质,具有多种生物学活性和免疫原性。牙龈蛋白分为牙龈蛋白酶R(Rgp)和牙龈蛋白酶K(Kgp),具有结合、吸收、聚集血红蛋白的能力,可以降解和灭活免疫球蛋白,有效抑制中性粒细胞产生氧,抑制其杀菌作用,使牙龈卟啉单胞菌细胞避免被噬菌细胞攻击。Kgp能分解纤维蛋白原和纤维蛋白,从而干扰血凝块的形成使凝血酶时间延长,引起病变组织出血。Rgp能促进牙龈成纤维细胞产生干细胞生长因子,参与牙周病的炎症和修复过程。牙龈蛋白能破坏血管内皮细胞中细胞因子的反应系统,降低其黏附性和细胞活性,在引起牙周病的同时参与心血管疾病发生。牙龈蛋白能直接作用于结合上皮,降解细胞之间的连接,破坏结合上皮结构和功能的完整性,为牙龈卟啉单胞菌侵入牙周组织进一步发挥致病作用创造条件。在免疫功能上,抗牙龈蛋白抗体可避免上牙槽骨的吸收。四环素族药物等抑制剂可抑制牙龈蛋白活性,提高宿主对牙龈卟啉单胞菌的抵抗力。

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K的基因克隆和序列分析

利用PCR方法 ,分别扩增牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K (KGP)的催化结构域 (KGPcd)和凝集素结构域 (KGP hag)的基因片段 ,将基因片段插入pGEM TeasyVector,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定 ,KGPcd和KGP hag的序列与国外文献报道一致。克隆到牙龈卟啉菌KGP的KGPcd和KGP hag基因 ,为体外表达其活性蛋白奠定了基础。

牙龈卟啉单胞菌重组牙龈蛋白酶刺激牙龈成纤维细胞内钙离子浓度变化及其机制

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌重组牙龈蛋白酶(r Rgp B)刺激蛋白酶激活受体(PAR)介导的人牙龈成纤维细胞(HGF)内钙离子浓度([Ca^(2+)]i)的动态变化及细胞内信号转导通路。方法:流式细胞术检测HGF表达的PAR类型,CCK-8法检测细胞增殖,以牙龈卟啉单胞菌r Rgp B作用于HGF,激光共聚焦显微镜观察HGF内[Ca^(2+)]i的动态变化及PAR-1拮抗剂的阻断作用;蛋白质印迹法检测HGF内c-Jun氨基末端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)、p65蛋白水平的变化。结果:HGF表达PAR-1和PAR-3,且r Rgp B可促进HGF生长。细胞受到r Rgp B作用后能激发瞬时增强的[Ca^(2+)]i荧光信号,并且这种作用能够被PAR-1拮抗剂完全阻断;与空白对照组比较,r Rgp B诱导细胞6、12 h后,JNK、ERK1/2、p65磷酸化蛋白表达均显著上调(均P<0.05),但p38 MAPK磷酸化蛋白水平未见明显变化(P>0.05);PAR-1拮抗剂成功抑制了r Rgp B诱导的JNK、ERK1/2、p65磷酸化蛋白表达的上调。结论:r Rgp B通过PAR-1诱导HGF内[Ca^(2+)]i增加,并激活细胞内JNK、ERK1/2、核因子κB信号通路。

青春期龈炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K的表达

目的:检测并比较青春期龈炎的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K(Kgp)的表达强度,揭示Kgp与青春期龈炎之间可能存在的致病关系。方法:受试对象为14～17岁青春期龈炎患者36例,检测并记录受检者的各牙周指数GI、SBI和PD测值,取龈下菌斑进行P.gin-givalis的分离培养,16SrRNAPCR法鉴定。将P.gingivalis临床分离株于对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,用抗KgpN-末端IgG亚基的单克隆抗体进行Westernblot检测,采用SPSS11.0软件包,秩相关检验分析Kgp的表达强度与各牙周指数之间的相关关系。结果:青春期龈炎的P.gingivalis临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中,KgpN-末端IgG亚基的表达强度与各牙周指数数值的高低有正相关关系,统计学上有显著性差异(P<0.01)。结论:Kgp对青春期龈炎有一定的致病作用。

牙龈蛋白酶对M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子的调控作用

目的:探讨牙龈蛋白酶对M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子的调控作用。方法:采用sheets改良法从Pg ATCC 33277培养物上清中制备牙龈蛋白酶,应用质谱法鉴定牙龈蛋白酶,底物发色法测定酶活性,鲎试剂检测牙龈蛋白酶中LPS残留量。体外细胞模型实验评价牙龈蛋白酶对大肠杆菌脂多糖(Ec-LPS)诱导的M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子的影响。实验分为3组:阴性对照组、Ec-LPS组和Ec-LPS+牙龈蛋白酶组,采用qRTPCR和ELISA法检测M1型巨噬细胞表达的抑菌细胞因子白细胞介素12(IL-12)、一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素10(IL-10)在基因和蛋白水平的表达情况。结果:制备的牙龈蛋白酶为RgpA,活性20U/L,LPS残留量<0.01EU/mL。qRT-PCR和ELISA结果显示,与阴性对照组相比,Ec-LPS组IL-12和iNOS基因和蛋白的表达水平明显升高,IL-10的表达降低,即成功诱导M1型巨噬细胞,组间有显著差异(P<0.01);Ec-LPS+牙龈蛋白酶组IL-12、iNOS和IL-10基因和蛋白的表达较Ec-LPS组显著降低,但高于阴性对照组,组间有显著差异(P<0.01)。结论:牙龈蛋白酶具有抑制M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子IL-12、iNOS的作用。

牙龈蛋白酶及其致病作用

牙龈卟啉单胞菌是引起和加重牙周炎的重要致病菌,其分泌的牙龈蛋白酶是其主要的毒力因子之一。本文就牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶以及牙龈蛋白酶对细菌生长和黏附的影响、对组织的破坏作用、对宿主防御机制的作用等研究进展作一综述。

BMP-7在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中的保护作用

目的:研究牙龈蛋白酶对成骨细胞MC3T3-E1的增殖及凋亡的作用,以及BMP-7在此过程中的保护作用。方法:分离提纯牙龈蛋白酶,建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型,使用MTT法、TUNEL/DAPI染色法检测牙龈蛋白酶对成骨细胞增殖及凋亡的影响,并且研究BMP-7对于牙龈蛋白酶造成的细胞凋亡的保护作用。结果:牙龈蛋白酶呈剂量和时间依赖性地抑制成骨细胞增殖,诱导成骨细胞凋亡。在500和1000 ng/ml浓度范围内,BMP-7呈剂量依赖性地减轻牙龈蛋白酶对成骨细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。结论:BMP-7能有效抵抗牙龈蛋白酶诱导产生的成骨细胞增殖抑制及细胞凋亡。

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K对人牙周膜细胞增殖的影响

目的探讨牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K对人牙周膜细胞增殖的影响。方法组织块法体外培养人牙周膜细胞,不同浓度的牙龈蛋白酶K作用于人牙周膜细胞24h,对照组为无牙龈蛋白酶K作用的人牙周膜细胞。浓度为12.5μg/ml牙龈蛋白酶K分别作用于人牙周膜细胞24、48、72、96h,对照组也培养相同的时间。采用MTT法检测人牙周膜细胞的增殖,比较实验组与对照组人牙周膜细胞增殖的变化,数据采用单因素方差分析及独立样本t检验。结果牙龈蛋白酶K浓度在6.25～50μg/ml时,作用24h,实验组人牙周膜细胞的增殖低于对照组;牙龈蛋白酶K浓度为12.5μg/ml,作用24～96h,实验组人牙周膜细胞的增殖低于对照组,有显著性差异。结论牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K可抑制体外培养的人牙周膜细胞增殖,并呈剂量和时间依赖性。

牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响

牙龈卟啉单胞菌分泌的牙龈蛋白作为牙周病的一种重要的毒力因子,一方面通过降解骨保护蛋白(OPG)及促进核因子-κB(NF-κB)受体活化因子配体(RANKL)的释放激活OPG/RANKL/NF-κB受体活化因子信号转导通路,进而诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化,增强破骨细胞功能;另一方面,牙龈蛋白可通过线粒体依赖性内在程序性细胞死亡通路和肿瘤坏死因子受体家族介导的外在程序性细胞死亡通路诱导成骨细胞程序性细胞死亡,抑制成骨细胞功能,最终导致牙槽骨丧失。本文就近年来牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响相关研究进展作一综述。

牙龈蛋白酶R和蛋白酶激活受体在牙周炎中的作用

牙龈卟啉单胞菌是公认的牙周重要的致病菌,其分泌的牙龈蛋白酶R是其主要的毒力因子之一。蛋白酶激活受体是一种可识别多种分子的跨膜蛋白,牙龈蛋白酶R通过激活该受体在牙周炎的发生发展过程中发挥着重要的作用。本文就牙龈蛋白酶R和蛋白酶激活受体组成和生物学特性,牙龈蛋白酶R对蛋白酶激活受体的激活作用等研究进展作一综述。