利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛β酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体,设计不同的同源臂,成功地敲除了β酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列,插入新的基因,研究其表达功能,或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。

牛β-酪蛋白座位无启动子基因打靶载体的构建

将带有新霉素基因(neo)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的质粒pEGFP-C1进行了改造,去掉neo基因的启动子(Psv40),在无启动子的neo和完整的GFP基因两侧分别加入一个LoxP位点。然后将带有LoxP位点、筛选标记基因和报告基因的结构装入左右分别为牛β-casein基因1590bp和5833bp的同源臂结构中,构建成无启动子基因打靶载体pT-1590-LoxP-GFP-LoxP-5833。