牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494bp的目的片段,同时用BamHⅠ和HindⅢ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。

牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

基于海口市动物基因工程重点实验室获得的牛乳状瘤病毒13型(BPV-13)基因组序列信息(GenBank登录号:KM258443.2),以基因组为模板,扩增E5基因片段,将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-E5-N1,测序正确后瞬时转染HEK293细胞,应用荧光显微镜、流式细胞仪、Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果显示,E5片段大小为135bp;重组质粒pEGFP-E5-N1构建正确;荧光显微镜下观察转染重组质粒pEGFP-E5-N1的HEK293细胞,可见明亮的绿色荧光;流式细胞术分析结果显示,转染重组质粒pEGFP-E5-N1 48h后,约55.59%的细胞表达绿色荧光蛋白;Western blotting结果表明,表达的融合蛋白大小约为32ku。本试验结果为下一步研究E5基因的作用机理奠定了基础。

广西黄牛乳头状瘤病毒的鉴定及其基因组序列分析

【目的】明确广西黄牛是否存在牛乳头状瘤病毒(Bovine papillomavirus,BPV)感染,为今后制定科学的防控措施提供参考依据。【方法】从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的皮肤上采集瘤状物病料,在临床观察和组织病理学观察的基础上,采用PCR对其进行鉴定和基因型分型,再根据鉴型结果设计5对特异性引物对BPV基因组进行扩增及测序分析。【结果】黄牛皮肤瘤状物的病理组织切片观察发现,表皮与真皮增生,表皮细胞角质化和空泡化,细胞呈梭形或星形。从瘤状物中分离获得1株毒株,其与BPV-1型的同源性达99.0%,命名为BPV-GX-LA150909。BPVGX-LA150909毒株基因组全长7946 bp,Gen Bank登录号为MF435918,包含早期基因区(E区)、晚期基因区(L区)和非编码区(NCR区)3个区域。BPV-GX-LA150909毒株无论是其基因组还是L1基因,均与BPV-1型的同源性最高,尤其与贵州株BPV-1 GZLZ的同源性分别为99.9%和99.7%,且在系统发育进化树上也是与BPV-1 GZLZ的遗传距离较近。BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白具有潜在的B细胞抗原表位,含有17个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点。【结论】广西黄牛群中已存在BPV-1型感染,且与国内外BPV-1型的同源性较高,说明BPV跨地区传播是不可忽视的问题。