牛乳头瘤病毒基因1型贵州GZLZ流行株全基因组序列测定及分析

为了解牛乳头瘤病毒(BPV)GZLZ流行株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,本研究首先提取贵州六枝患病牛皮肤肿瘤样品DNA,以BPV L1基因的简并引物对其进行PCR扩增,测序并构建BPVL1基因进化树确定其为BPV1基因型。根据GenBank中BPV1参考株设计7对特异性引物,经扩增、测序、拼接后获得BPV流行株全基因组序列。序列分析显示,贵州六枝GZLZ流行株基因组全长为7 946 bp,具有BPV1基因型的结构特征。本研究为贵州地区的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律以及科学的防控提供依据。

牛乳头瘤病毒基因1型广西GX01流行株全基因组克隆及序列分析

为了解牛乳头瘤病毒1型(bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1)广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株(M20219.1)、BPV-13型参考株(JQ798171.1)同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。

牛乳头瘤病毒2型L1基因的克隆及原核表达

为表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因,本研究采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料样品中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆至pMD18-T载体中,测序后进行分析。将BPV2沙湾株L1基因亚克隆于原核表达质粒pGEX4T-1中,经IPTG诱导L1蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和western blot分析。SDS-PAGE分析显示,诱导后能够表达分子量80 ku的重组蛋白;western blot显示该蛋白可以与抗BPV2多克隆抗体发生反应。小鼠免疫试验表明,BPV2 L1重组蛋白可以诱导小鼠产生抗BPV2 L1特异性抗体;琼脂扩散试验显示,重组L1蛋白具有良好的免疫原性。本研究原核表达BPV2 L1蛋白,并证明其具有良好的反应原性及免疫原性,为牛乳头瘤病的疫苗和诊断试剂研发奠定了基础。

牛乳头瘤病毒2型L1基因真核表达载体的构建及真核表达

为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。

新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达

本研究以构建牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达系统pET32a-L1及表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白为目的,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础。从牛体表赘生瘤组织中提取DNA,PCR扩增L1基因片段,克隆至pGM-T载体。测序成功后将目的片段和表达载体经双酶切连接于表达载体pET32a中,并构建重组质粒pET32a-L1。重组质粒经双酶切、测序鉴定后转入表达宿主BL21中,IPTG诱导后表达融合蛋白L1,通过SDS-PAGE电泳和Westernblot进行鉴定。结果显示,pET32a-BPV-1-L1重组质粒构建成功。经SDS-PAGE鉴定,诱导后表达的重组蛋白L1相对分子量约为75 kD,与预期结果大小一致;经Western blot检测牛乳头瘤病毒1型L1蛋白能与Anti-HPVantibody[BPV-1/1H8+CAMVIR]单克隆抗体产生反应。pET32a-BPV-1-L1原核表达系统得以成功构建并能表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白。

牛乳头瘤病毒基因2型流行株全基因组的克隆及序列分析

为了解牛乳头瘤病毒(Bovine Papillomavirus,BPV)新疆流行株基因型及其基因组遗传变异情况,用乳头瘤病毒L1基因简并引物FAP59/FAP64对新疆沙湾县奶牛皮肤肿瘤组织样品进行PCR扩增,测序后确定,BPV基因型;设计6对BPV基因型特异性引物,经扩增、测序、拼接后获得BPV流行株全长基因组序列。L1基因序列分析表明,BPV2-SW01流行株为BPV-2基因型;该毒株基因组全长7 944bp,包括E6、E7、E1、E8、E2、E4、E3、E5、L2和L1 10个开放阅读框(ORF)。遗传进化树分析显示,BPV2-SW01归于Delta乳头瘤病毒属,与BPV-1和BPV-13进化关系最近。