新型牛乳铁蛋白衍生肽LFcinB-W的抗感染作用

抗菌肽有望替代抗生素成为一种安全、绿色、高效的理想抗菌剂,牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferricin,LFcinB)是由牛乳铁蛋白经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的短肽。文章以牛乳铁蛋白肽为基础,根据抗菌肽结构与功能的关系,对LFcinB的结构进行优化设计得到衍生肽LFcinB-W。将设计得到的LFcinB-W基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体,转化毕赤酵母细胞GS115诱导表达。对发酵上清液进行分离纯化和活性测试,结果证明该衍生肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有更强的抑菌活性;利用病原体Erwinia carotovora carotovora 15(Ecc15)感染模式生物果蝇肠道,进一步探究LFcinB-W对感染模型的保护作用,结果显示LFcinB-W可有效缓解病原体感染对果蝇造成的损伤,在体内表现出比LFcinB更好的抗感染作用,为进一步研究该肽的生物活性及生产应用提供参考。

饲料中添加牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼生长性能、消化酶活力、肠道组织结构及抗病力的影响

为探讨饲料中添加不同水平牛乳铁蛋白肽(Bovine lactoferricin,LfcinB)对大口黑鲈(Micropterus salmoides)幼鱼生长性能、消化酶活力、肠道组织结构及抗病力的影响,试验选取了初均重为(19.88±0.03)g的450尾大口黑鲈,随机分成5组,每组3个重复,分别在基础饲料中添加0(阴性对照组)、1000、1500和2000 mg/kg牛乳铁蛋白肽,并设置基础饲料+30 mg/kg氟苯尼考为阳性对照组,共5种试验饲料。试验周期为8周。结果表明:(1)随着牛乳铁蛋白肽添加量的增加,大口黑鲈的末均重(FBW)、增重率(WGR)和特定生长率(SGR)均呈现先升高后降低的趋势,1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽组大口黑鲈的生长性能最好且与对照组(阴性对照、阳性对照)对应数据差异显著(P<0.05)。(2)与两个对照组比,1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽组大口黑鲈的肠道胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活力均显著上升(P<0.05)。(3)与两个对照组比,饲料中添加1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽可显著提高大口黑鲈前肠、中肠及后肠的绒毛高度和宽度(P<0.05)。(4)采用嗜水气单胞菌进行攻毒后,牛乳铁蛋白肽组大口黑鲈的成活率均高于阴性对照组而与阳性对照组无显著差异(P>0.05)。综上所述,在试验条件下,饲料中添加牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼有促生长作用,适宜添加量为1000 mg/kg,同时牛乳铁蛋白肽能提高大口黑鲈肠道消化酶活力,改善肠道组织结构,提高抗病力。

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamHI和XhoI位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1(+)经BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。

用甲酸水解制备重组牛乳铁蛋白肽LfcinB(17-41)

根据大肠埃希菌密码子偏嗜性合成了LfcinB(17-41)的基因序列,将该序列亚克隆到pGEX-4T-1载体中,在大肠埃希菌BL21菌株中用IPTG诱导表达。LfcinB与GST融合,两者之间加入了甲酸裂解位点。BL21在30℃下培养融合蛋白GST-LfcinB可溶性表达较好。纯化的GST-LfcinB用甲酸水解释放P1-LfcinB。抑菌试验显示P1-LfcinB对兔源致病性大肠埃希菌有抗菌活性。

牛乳铁蛋白肽及其衍生肽生物活性与研究进展

牛乳铁蛋白肽(Lfcin B)是牛乳铁蛋白N-端在正常的消化环境下水解产生的25个氨基酸残基的短肽,具有广谱高效的抗细菌性,抗病毒,抗肿瘤等多种生物活性。作为一种新型抗菌肽,Lfcin B及其衍生肽具有很大的研究价值和潜在的应用价值。对其结构及生物学活性进行介绍,并对近年来采用基因工程技术表达Lfcin B及其衍生肽的方法技术进行了综述。

牛乳铁蛋白素-马盖宁杂合抗菌肽的设计、合成及抑菌活性

根据抗菌肽牛乳铁蛋白素(Lfcin B)与马盖宁(Magainin)的核心功能序列,将Lfcin B(1-15)和Magainin(1-12)二者连接起来,设计一种新型杂合抗菌肽LFB15-MA12,采用固相化学合成法合成获得纯度大于95%的LFB15-MA12。微量肉汤稀释法测得LFB15-MA12对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、绿脓杆菌ATCC27853、鼠伤寒沙门氏菌C77-31四种细菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibition concentration,MIC)分别为16、64、64和32μg·mL-1,在抑菌浓度范围内未表现出溶血活性。获得了一种具有较高抗菌活性且安全无毒的新型抗菌肽,为研究开发理想的新型抗菌肽分子提供了新思路。

牛乳铁蛋白十肽的基因改造、克隆及表达

目的克隆并表达牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因。方法参照大肠杆菌偏爱密码子,分别针对牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,设计并合成两个具有相同黏性末端的DNA片段,同时在其基因前后分别加上天冬酰胺和甘氨酸的密码子,构成羟胺裂解位点,通过连接获得其二拷贝基因同向串联体。分别将该串联体克隆至载体pUC18上,经双酶切、PCR及测序鉴定后,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物纯化后,用凝血酶切割及羟胺裂解。结果获得了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2二拷贝基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出相对分子质量约29000的目的蛋白条带,纯化后的蛋白经凝血酶切割后,相对分子质量约29000的目的蛋白条带消失。结论已成功克隆并表达了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,为基因工程抗真菌肽的制备奠定了基础。

重组牛乳铁蛋白肽包含体的复性与纯化

通过分析透析液pH值,包含体蛋白浓度,DTT浓度3个参数对复性率的影响,确定了重组牛乳铁蛋白N-末端多肽(pGEX-4T1/rbLF-N)包含体透析复性的最佳条件和复性后蛋白纯化的适宜方法。采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B柱(Glutathione SapharoseTM 4B)对复性后的蛋白溶液进行纯化,纯化后的融和蛋白经胃蛋白酶酶解并检测其酶解产物的抗菌活性。试验表明包涵体蛋白可以部分复性。当pH值为8.5,包含体蛋白质量浓度为100mg/L,DTT浓度为24 mmol/L时,包含体的复性率最高。纯化后的融合蛋白酶解产物具有抗菌作用。

重组牛乳铁蛋白N末端多肽对真空包装猪肉品质的影响

以Nisin和乳酸作为参照,采用本试验室获得的重组牛乳铁蛋白肽对生鲜猪肉进行保藏试验。生鲜猪肉浸沾并真空包装后置于4℃下存放,测定肉样的微生物数、抗氧化值(TBA)、pH值、肉的红度值(Huntera)及感官评价。结果显示,重组的牛乳铁蛋白肽保鲜效果优于Nisin组,接近乳酸组。其保鲜期可达到19d。

牛乳铁蛋白抗菌肽抗肺癌细胞增殖及其作用机制研究

目的探讨牛乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)抗人肺癌细胞功能及其作用机制。方法体外培养人肺腺癌A549细胞株,实验分为:阴性对照组、LfcinB处理组和阳性对照组。采用MTT法检测LfcinB对人肺腺癌A549细胞增殖的影响,流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率。结果与阴性对照组比较,不同浓度的LfcinB均对A549细胞增殖有抑制作用,其中以10-2g/L浓度LfcinB的抑制率最高(P<0.01)。与阴性对照组比较,不同浓度的LfcinB作用于A549细胞24、48、72 h后,G0/G1期细胞略有减少,S期细胞逐渐增多,G2/M期细胞略有减少,且在72 h结果最为显著(P<0.01)。Lf-cinB在10-6～10-2g/L浓度范围内作用48、72 h均可诱导A549细胞凋亡,随着药物浓度增高,诱导凋亡作用加重,有明显的剂量效应关系。结论 LfcinB能显著抑制人肺腺癌A549细胞增殖,使细胞阻滞于S期,并诱导细胞凋亡。

改进Tricine-SDS-PAGE法分析重组牛乳铁蛋白肽

为了有效分离3.1kDa乳铁蛋白肽,试验调整分离胶中聚丙烯酰胺浓度及凝胶的交联度,并加入适量甘油,改进了传统的Tricine-SDS-PAGE方法。结果表明,该方法与常规的SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE相比较,改进的凝胶不仅可以有效分离3.1kDa的肽,而且对分子量为212kDa的大分子量蛋白也有很好的分离效果,明显优于常规的SDS-PAGE和现有的Tricine-SDS-PAGE方法。

牛乳铁蛋白肽对隐性乳房炎奶牛产奶量、体细胞及乳成分的影响

本试验以年龄、胎次、泌乳天数、产奶量相近,体细胞数在50万～150万个·mL-1范围内的荷斯坦奶牛为研究对象,设置对照组和试验组,分别灌服生理盐水和牛乳铁蛋白肽,研究灌服牛乳铁蛋白肽对患隐性乳房炎奶牛产奶量、体细胞数及乳成分的影响。结果表明:(1)与0 d相比,30 d时试验组奶牛产奶量显著提高了8.54%(P<0.01),而对照组则显著降低了18.30%(P<0.01),且试验组奶牛产奶量比对照组高33.37%,差异显著(P<0.05);(2)与0 d相比,30 d时对照组和试验组奶牛体细胞数分别显著降低了75.09%(P<0.01)和83.72%(P<0.01),且后者较前者低32.92%,但差异不显著(P>0.05);(3)灌服牛乳铁蛋白肽后,奶牛乳成分指标中干物质含量、乳脂率、乳蛋白率和无脂固形物含量较灌服前均有一定程度的下降,而乳糖和尿素氮含量则有一定幅度的上升,但差异均未达显著水平(P>0.05)。综合而言,牛乳铁蛋白肽对隐性乳房炎的治疗有一定的辅助效果,可显著提高隐性乳房炎奶牛日产奶量并降低体细胞数。

牛乳铁蛋白活性肽（LactoferricinB）（3—17）与蜂毒肽（Melittins）（6—12）杂合多肽活性功能的测定

抗菌肽近年逐渐成为研究的热点。将牛乳铁蛋白活性多肽（LfcinB）与蜂毒肽（Melittins）核心功能区间，即LfcinB的3-17位的15个氨基酸与Melitins的6-12位的8个氨基酸，固相合成新的多肽分子Lfb15-Me8。经RT-HPLC和质谱检测合成多肽分子准确，纯度达到98％以上。经体外抑菌实验证明，所合成的新型抗菌肽分子对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、绿脓杆菌ATCC27853、酵母GS115、沙门氏菌ATCC12291的最小抑菌浓度（MIC）分别为16μg·mL^-1、32μg·mE-164μg·mL^-1、128μg·mL^-1、16μg·mL^-1，并在其抗菌浓度下并未表现溶血特性。获得了具有活性的新型多肽序列，为抗菌肽的研发奠定了新的研究内容。

牛乳铁蛋白抗菌肽(Lactoferricin)基因的克隆与表达质粒构建

按大肠杆菌偏爱密码子设计了牛乳铁蛋白肽的3段引物序列,通过PCR合成BeL1-2-3,经双酶切后克隆入pED质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体,转化至E.coliBL-2(1 DE3),获得牛的乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆菌经诱导后,可表达出可观的融合蛋白,且表达量与诱导时间呈一定相关性。

重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用。试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA/LR-CO21、含有空载体质粒的重组猪源罗伊氏乳杆菌pPG/LR-CO21和磷酸盐缓冲液(PBS)各4 mL,连续口服3 d,口服后观测时间为14 d。期间仔猪自由采食,记录各组仔猪体重变化和腹泻情况。试验2:选取30头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为5组,分别口服1、3、6、9、12 mL半数组织培养感染剂量(TCID 50)为10-7.50/mL的TGEV。设置7 d时间为观察期,分析半数致死量的条件。试验3:另选取1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪32头,随机分为4组,分别为重组菌组、空载菌组、对照组、TGEV感染组,每组8个重复,每个重复1头仔猪。试验组每天每头按照2×1010 CFU的剂量口服pPG-LFCA/LR-CO21、pPG/LR-CO21及等体积的PBS,连续口服饲喂1周,在8日龄按照半数致死量口服TGEV感染,感染7 d后进行样品采集。记录各组仔猪体重变化和腹泻情况;苏木精-伊红(HE)染色检测小肠绒毛高度及隐窝深度;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测仔猪血清中总免疫球蛋白G(IgG)和肠黏液总分泌型免疫球蛋白A(sIgA)抗体含量;实时荧光定量PCR检测紧密连接蛋白相关基因封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)以及炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Toll样受体2(TLR2)的mRNA相对表达量;对仔猪盲肠内容物进行菌群结构分析。结果表明:口服重组猪源罗伊氏乳酸杆菌后,与对照组相比,重组菌组新生仔猪的平均日增重极显著提高(P<0.01),而腹泻率降低且差异极显著(P<0.01);与TGEV感染组相比,重组菌组仔猪平均日增重增加且腹泻率降低,差异显著(P<0.05);空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度的比值显著增加(P<0.05);仔猪血清中总IgG和肠黏液总sIgA抗体含量显著升高(P<0.05);肠黏膜组织中紧密连接蛋白相关基因Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),血清中细胞因子TNF-α含量极显著降低(P<0.01),血清IFN-γ、IL-6、IL-8、TLR2含量极显著升高(P<0.01),仔猪存活率提高。对仔猪盲肠内容物进行菌群多样性分析结果显示,TGEV感染仔猪后肠道正常菌群占比下降,相比于TGEV感染组,口服重组菌的仔猪肠道菌群致病菌拟杆菌属占比下降,差异显著(P<0.05),菌群多样性更接近对照组,肠道菌群的代谢、遗传信息处理等功能均有所增强。综上所述,本试验成功构建了分泌表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌菌株,经口服途径饲喂新生仔猪后,能够促进仔猪生长,降低新生仔猪的腹泻率,经口服途径饲喂感染TGEV的新生仔猪后,可以改善肠道环境,降低病毒对仔猪肠道的损伤,对仔猪抗TGEV感染提供有效保护。

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌对雏鸡抗鸡白痢沙门氏菌感染的效果研究

为探索表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对雏鸡抗鸡白痢沙门氏菌感染效果的影响,本实验将该重组乳酸乳球菌饲喂1日龄雏鸡,连续饲喂14 d,并设立空白对照组,第7 d时经灌服鸡白痢沙门氏菌同时感染实验组和对照组,连续观察7 d;分别于攻菌前以及攻菌后的不同天数采集血清及盲肠黏液,检测结果显示攻菌后饲喂重组乳酸乳球菌组雏鸡血清中IgG以及黏液中SIgA的含量极显著高于空白对照组。对各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏及十二指肠进行病理组织学检查,结果显示饲喂重组乳酸乳球菌组各器官的病变情况相对较轻,而且雏鸡盲肠扁桃体中非特异免疫信号通路中相关分子TLR4、My D88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6等的m RNA表达相对较高。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌在抗鸡白痢沙门氏菌感染的过程中可以起到保护雏鸡免受感染的作用。

牛乳铁蛋白肽的研究现状与应用前景

牛乳铁蛋白肽是牛乳铁蛋白在胃蛋白酶水解作用下释放出的一种含25个氨基酸残基的短肽,具有广泛而高效的抑菌活性,是一种新型的抗菌肽,在医药、食品添加剂乃至饲料业有着巨大的开发潜质。对其结构、理化性质、生物学功能、作用机制及应用前景进行详细论述,并对乳铁蛋白肽的衍生肽的研究及策略进行探讨。

重组牛乳铁蛋白肽衍生肽设计及其在毕赤酵母中的表达

利用抗菌肽数据库和生物信息学分析工具,基于抗菌肽结构和功能的关系,设计了LFcinB衍生肽LFcinB-W4,10。为了验证衍生肽设计的合理性及表达产物功能正确性,将优化设计的基因序列经限制性内切酶酶切后,用T4DNA连接酶连接到分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组表达载体pPIC9K-LFcinB-W4,10经线性化后电转入毕赤酵母GS115中,经过G418浓度梯度筛选得到高拷贝转化子。经PCR鉴定,目的基因与酵母基因组稳定整合。阳性转化子经体积分数为2.5%的甲醇诱导表达,表达产物用Tricine-SDS-PAGE检测到相对分子质量约为3.2kDa的衍生肽LFcinB-W4,10。每24h取样检测发酵上清液抑菌活性,结果表明,抗菌肽LFcinB-W4,10对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性,诱导表达96h时其抑菌圈直径最大。实验为探究牛乳铁蛋白肽功能-结构关系奠定了基础。

牛乳铁蛋白肽的抑菌功能及基因工程制备进展

牛乳铁蛋白肽(lactoferricin bovine,Lfcin B)是由乳铁蛋白(lactoferrin)经酸性胃蛋白酶降解N端而产生的含25个氨基酸残基的小肽,它具有抗菌、抗癌、抗氧化、免疫调节等一系列生物活性,成为目前研究与开发的热点。由于受到生产成本的限制,无法进行大规模商业化生产,基因工程技术将是实现大规模生产的最佳途径。对牛乳铁蛋白肽的抑菌功能以及基因工程制备的优势和改良方法进行了综述,旨在为基因工程生产牛乳铁蛋白肽提供新思路。