秦川牛宰后成熟期间基础免疫球蛋白对其肉品质变化的影响

为探究宰后成熟期间基础免疫球蛋白(basal immunoglobulin,BSG)表达对肉品质的影响,测定4℃条件下秦川牛在不同贮藏期(0、2、4、6、8 d)内pH值、蒸煮损失以及肌原纤维小片化指数(myofibril fragmentation index,MFI)等品质指标、能量物质变化以及BSG的含量变化。并利用4D-非标记定量组学技术分析蛋白质组学的变化情况。结果表明:在秦川牛宰后贮藏期内,BSG表达量总体呈先上升后下降趋势;能量基本物质ATP、ADP、AMP、NADH水平均呈下降趋势;pH值、蒸煮损失呈先降低后升高的趋势;MFI呈持续上升趋势;相关性分析结果表明,秦川牛在宰后成熟期BSG的表达量与蒸煮损失呈极显著正相关(P<0.01);与pH值、ATP和NADH水平呈显著负相关(P<0.05);而与ADP含量、AMP含量无显著相关性。故秦川牛背最长肌在成熟期间BSG表达量变化与牛肉的品质及能量代谢存在密切关系。蛋白质组学鉴定出BSG及其相关差异蛋白质在细胞内具有催化活性、水解酶活性、质子转运ATP合酶活性,并与ATP、核糖核苷酸、碳水化合物衍生物结合,同时参与分子功能的调节、氢离子跨膜转运等,以上生物功能的作用造成线粒体损伤,通过能量代谢过程参与肉品嫩度的变化。

基于牛流行热病毒G蛋白的免疫胶体金检测方法的建立

【目的】建立牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)的免疫胶体金检测方法,为牛流行热(BEF)诊断提供研究基础。【方法】构建原核表达载体pET32a-BEFV-G,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达,对诱导成功后的表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western blotting鉴定。以纯化后的蛋白作为特异性抗原包被检测线,以链球菌G蛋白作为金标抗原,与金纳米颗粒结合后标记在金标垫上,用羊抗鼠IgG作为质控线,通过优化不同的反应条件,建立检测BEFV的免疫胶体金检测方法,并对试纸条进行敏感性、特异性和重复性检测。【结果】SDS-PAGE结果显示,在IPTG终浓度为0.75 mmol/L时,37℃诱导8 h的条件下重组BEFV G蛋白表达量最大,且以包涵体形式表达,分子质量约为46 ku。Western blotting结果显示,浓缩纯化后的重组BEFV G蛋白具有较好的反应原性,可作为包被抗原用于免疫胶体金试纸条的建立。在质控线包被的抗体羊抗鼠IgG浓度为2 mg/mL,BEFV G蛋白包被浓度为0.6 mg/mL,喷金量为2.5μL/cm的条件下,3~5 min就可完成检测。制备的试纸条有较高的敏感性和特异性,血清稀释倍数为40倍的时候显色接近消线,且试纸条仅与BEFV阳性血清发生显色反应,与牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)等其他病毒阳性血清均无交叉反应,阳性血清样本重复性试验证明试纸条的重复性较高,成功建立了免疫胶体金检测方法。【结论】本研究以原核表达的G蛋白为抗原成功制备了检测BEFV的新型免疫胶体金试纸条,该检测试纸条特异性强、稳定性好,适合用于临床快速检测BEF。

基于上转发光和量子点免疫层析技术的牛免疫球蛋白G检测方法的研究与评价

为了建立一种快速检测牛免疫球蛋白G(IgG)的方法,试验从牛血清中提取和纯化IgG,用微量紫外分光光度计检测浓度,并每2周1次、分4次用牛IgG分别免疫2只大耳白兔制备兔抗牛IgG多克隆抗体,用酶联免疫吸附试验检测抗体效价。分别以上转发光颗粒(UPT)和量子点(QD)作为生物示踪物,结合双抗体夹心法和双抗原竞争法原理制备4种试纸条,分别为UPT-LF-夹心法、UPTLF-竞争法、QD-LF-夹心法和QD-LF-竞争法试剂条;4种试纸条层析膜质控带均为2 mg/mL羊抗兔抗体,夹心法和竞争法检测带分别为3 mg/mL兔抗牛IgG多克隆抗体和2 mg/mL牛IgG;配制0,0.1,0.3,0.5,0.7,1,3,5,7,10,30,50,70,100μg/mL浓度的牛IgG标准品,分别用4种试纸条进行检测,对试纸条的检出限、线性和精密性进行研究,筛选最优试纸条。用筛选到的最优试纸条和折光仪同时检测52份乳样中牛IgG含量,并抽取7份乳样用液相色谱进行检测。结果表明:提取的牛IgG浓度为67.6 mg/mL,2份血清中兔抗牛IgG多克隆抗体浓度分别为34 mg/mL和70 mg/mL,兔抗牛IgG多克隆抗体效价均为1∶102400。UPT-LF-夹心法、UPT-LF-竞争法、QD-LF-夹心法和QD-LF-竞争法试纸条的检出限分别为0.3,3.0,0.1,0.5μg/mL,线性拟合的相关系数(R2)分别为0.976,0.990,0.945,0.974,4种试纸条的精密性由大到小依次为UPT-LF-夹心法、UPT-LF-竞争法、QDLF-夹心法和QD-LF-竞争法,QD-LF-竞争法试纸条为最优的试纸条。折光仪和QD-LF-竞争法试纸条检测50份牛初乳样中牛IgG含量分别为20~80 mg/mL和50~230 mg/mL。7份乳样的QD-LF-竞争法试纸条与液相色谱检测牛IgG含量的相关性高达0.9759,而折光仪与液相色谱检测牛IgG含量的相关性仅为0.8274。说明与折光仪相比,QD-LF-竞争法试纸条检测牛IgG含量的准确性更高。

酶联免疫双抗体夹心法检测牛初乳素中免疫球蛋白IgG

〔目的〕建立检测牛初乳素为原料的保健食品中免疫球蛋白IgG的常用酶联免疫双抗体夹心法。〔方法〕分离纯化小牛血清中IgG,以牛IgG免疫新西兰兔,获得抗牛IgG的血清,分离纯化,制备兔抗牛IgG。〔结果〕1000ng/孔兔抗牛IgG饮被酶联板,3倍比稀释牛IgG,夹心法检测。〔结果〕在牛IgG0.031mg/ml-2.50mg/ml范围,浓度与吸光度值线性相关,方程为:y=0.358+0.767x,相关系数为r=0.995,当添加50mmIgG时,回收率为88.4％,变异系数为6.1％。〔结论〕该方法具有特异性强、快速、灵敏和分析成本低等特点。

免疫球蛋白G4相关性疾病研究进展

免疫球蛋白G4相关性疾病(IgG4-related disease IgG4-RD)是一种影响多器官的慢性系统性自身免疫性疾病。几乎可以累及全身任何组织器官,其中消化系统受累较为常见。IgG4-RD病因及发病机制仍未完全阐明,其诊断需联合辅助检查,综合评估,但组织病理活检仍是诊断IgG4-RD的金标准。目前认为糖皮质激素仍是IgG4-RD的一线治疗。本文通过对IgG4-RD的研究进展进行综述,旨在为临床提供参考。

抗牛免疫球蛋白G单克隆抗体的制备及鉴定

采用杂交瘤技术从90株融合株中筛选得到分泌抗牛免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)单克隆抗体的2F6、5E3、9C6、9H8四个细胞株。其抗体亚型均为IgG1型,腹水单克隆抗体的效价可达5.12×10~6;5E3、9H8识别牛IgG重链Fc片段,2F6识别牛IgG轻链Fab片段,9C6识别牛IgG重链Fab片段;9C6与牛IgG1和牛IgG2反应,与山羊IgG、绵羊IgG、兔IgG、牛IgM、牛乳酪蛋白、牛乳β-乳球蛋白、牛乳铁蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、鱼明胶的交叉反应率均小于1%;9C6亲合力常数达牛乳8.92×10~8 L/mol。

牛免疫球蛋白G的应用及检测研究进展

牛免疫球蛋白G(IgG)是一类具有多种生物活性的免疫因子,主要来源于牛初乳中,已成为功能性食品的重要营养添加成分,牛IgG的含量直接决定了此类产品的质量。本文对牛免疫球蛋白的生物活性及功能进行了概述,并对牛IgG含量分析检测技术进行了阐述。

标准NY/T2070-2011牛初乳中免疫球蛋白G测定不确定度研究

对牛初乳粉中免疫球蛋白IgG的测定过程进行分析,建立数学模型。评定各不确定度分量,合成标准不确定度,计算测定结果的扩展不确定度。结果表明:主要来源于标准曲线的拟合,样品的均匀性和样品前处理过程的一致性。当置信概率为95%,采用该方法测定试样中IgG的扩展不确定度为3.4,则试样中IgG的测量结果可表示为(28.3±3.4)%。

金标记免疫共振散射光谱法测定牛初乳中免疫球蛋白G

采用柠檬酸三钠还原法制备了粒径为9 nm的金纳米微粒。结果表明:在pH 7.0的Tris-HCl缓冲溶液中,金标记羊抗牛免疫球蛋白G(IgG)与牛IgG产生特异性结合,羊抗牛IgG包裹的金纳米微粒释放出来,在聚乙二醇-20000的作用下发生聚集,导致体系在580 nm处的共振散射峰增强。当牛IgG浓度在0.013 3～1.33μg/mL范围内,随着牛IgG浓度的增加,共振散射强度线性增强,方法的检出限为0.007 95μg/mL,用于定量分析牛初乳中的IgG,结果令人满意。

中国西门塔尔牛及其杂交牛屠宰性能、蛋白质代谢、免疫功能及抗氧化能力的差异

本试验旨在研究中国西门塔尔牛及其杂交牛屠宰性能、蛋白质代谢、免疫功能及抗氧化能力的差异。选择中国西门塔尔牛、中国西门塔尔牛与中国荷斯坦杂交牛(西荷杂交牛)、中国西门塔尔牛与蒙古牛杂交牛(西蒙杂交牛)各3头,测定其屠宰性能与血清生化指标。结果表明:3种育肥牛的初重、末重、胴体重、屠宰率以及平均日增重皆无显著差异(P>0.05)。西蒙杂交牛血清中肌酐(Cr)、白蛋白(ALB)的含量和谷草转氨酶(AST)的活性显著高于中国西门塔尔牛与西荷杂交牛(P<0.05)。西蒙杂交牛血清中肌酸磷酸激酶(CPK)的活性显著高于中国西门塔尔牛(P<0.05),而与西荷杂交牛无显著差异(P>0.05)。在3种育肥牛血清中,游离氨基酸(FAA)、尿素氮(UN)、总蛋白(TP)、尿酸(UA)的含量以及谷丙转氨酶(ALT)的活性均无显著差异(P>0.05)。西蒙杂交牛血清中免疫球蛋白M(IgM)的含量显著低于中国西门塔尔牛和西荷杂交牛(P<0.05),而中国西门塔尔牛与西荷杂交牛相比则差异不显著(P>0.05)。在3种育肥牛血清中,免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)的含量均无显著差异(P>0.05)。西蒙杂交牛血清中丙二醛(MDA)的含量显著高于中国西门塔尔牛和西荷杂交牛(P<0.05),而3种育肥牛血清中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及总抗氧化能力(T-AOC)则未表现出显著差异(P>0.05)。综上所述,3种育肥牛中,西蒙杂交牛具有更好的蛋白质代谢能力,而中国西门塔尔牛和西荷杂交牛的免疫力表现要稍好一些。

牛免疫球蛋白G的体外人源唾液酸化及Fc片段的制备

建立将牛免疫球蛋白G(bovine immunoglobulin G,bIgG)糖链末端N-羟乙酰神经氨酸酶切并连接人源N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)的方法,在实现bIgG转化为人源IgG(human IgG,hIgG)的基础上,研究hIgG可结晶(Fc)片段的制备。结果表明:以170 U/mL神经氨酸酶酶切bIgG(4.0 mg/mL)后,通过β-1,4-半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶分别转移半乳糖(galactose,Gal)和Neu5Ac残基,可制备增加8.4个Gal残基和42个Neu5Ac残基的hIgG分子。此外,在10.0 mg/mL hIgG、m(木瓜蛋白酶)∶m(hIgG)=0.05、10.0 mmol/L半胱氨酸激活剂、2.0 mmol/L EDTA溶液、pH 7.0条件下,酶解3 h可制得hIgG的较高纯度Fc片段,最终hIgG得率为71.7%,Fc片段得率为20.8%。本研究为bIgG的产品开发和营养价值评价提供科学依据。

牛血清中免疫球蛋白的提取研究

免疫球蛋白是生物体内一种重要的免疫活性物质,对生物体的多种器官和系统有重要影响。该试验采用40%饱和度硫酸铵盐析法、超滤法及盐析-超滤结合法,对牛血清免疫球蛋白进行分离提取,得到免疫球蛋白的粗提物。通过对三种方法的提取率和产品回收率的比较,确定采用盐析-超滤结合法提取效果最佳,其提取率为9.378mg/ml,产品回收率为91%,是一种适合于血清中免疫球蛋白粗提的有效方法。并确定盐析-超滤结合法的最佳试验条件如下:PBS缓冲液pH值为7.4;血清-PBS缓冲液比例为1:1。

牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化

选取饱和硫酸铵、辛酸-硫酸铵、饱和硫酸钠三种盐析方法,对牛血清中的免疫球蛋白进行分离提取,得到免疫球蛋白的粗提物。通过比较三种方法的提取得率和产品回收率确定采用饱和硫酸铵沉淀法提取效果最佳。其提取得率为9.06g/L,产品回收率为91%,是最适合对血清中免疫球蛋白进行粗提的盐析方法。

微型IgG免疫传感器的制备及其对人免疫球蛋白G的响应

以硅烷醇-戊二醛交联法在Ag电极表面制备的抗IgG膜电极为敏感器件,配以Ag/AgCl参比电极制备成微IgG免疫传感器.传感器基于免疫反应的原理,通过其电动势的变化对IgG的Nernst响应,测定人免疫球蛋白(hIgG)的含量.采用两种抗IgG膜电极的传感器,对hIgG的响应时间均小于6 min;线性范围在0.20～2.0 μg/L,检出限为0.1 μg/L.直接检测健康人血清中hIgG 的相对标准偏差为6.2% (n=5);加标回收率为93%～108%.以0.012 mol/L盐酸为再生液,传感器可重复使用,对IgG的活性在4℃可保持30 d.

胶体金免疫层析法快速检测配方羊奶粉中的牛β-乳球蛋白

建立了一种可快速检测配方羊奶粉中牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)的胶体金免疫层析检测方法。通过杂交瘤技术制备β-lg单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC_(50))为5.87μg/mL。将胶体金标记的β-lg mAb包被于金标垫,β-lg和山羊抗小鼠IgG标记于硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane,NC膜)分别作为检测线(T线)和质控线(C线),开发了可检测β-lg的免疫层析试纸条。该试纸条对β-lg的检测限(limit of detection,LOD)值为50μg/mL,与其他基质成分均未产生有效交叉反应,对全脂山羊乳粉中掺杂脱脂牛奶粉(nonfat skim milk,NFSM)、脱盐乳清粉(desalted whey powder,DWP)和乳清蛋白粉(whey protein powder,WPP)的LOD值分别为5%、5%和0.1%。运用该方法对9个市售配方羊奶粉进行分析,检测结果与商品化酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒一致。该方法前处理快速简单,5 min即可裸眼判定结果,可用于配方羊奶粉商品的现场快速检测。

表面增强拉曼光谱对免疫球蛋白IgG分子与银基底作用的研究

采用高灵敏度的表面增强拉曼光谱(SERS)技术,以具有强SERS信号的金纳米粒子标记抗体,以此SERS标记免疫金溶胶为探针,结合扫描电镜技术,研究免疫球蛋白羊抗小鼠IgG分子与银基底的相互作用。我们发现,羊抗小鼠IgG分子可直接与银基底通过疏水作用或形成Ag-S键而牢固结合。为消除这种非特性吸附,本文以小牛血清白蛋白(BSA)封闭银基底,取得了较好的效果。

纳米磁性微球快速分离纯化牛血清免疫球蛋白

研究纳米磁性微球(MNPs)快速分离纯化牛血液中免疫球蛋白(IgG)。研究结合液(磷酸盐缓冲溶液)和解离液(醋酸钠缓冲溶液)pH、NaCl浓度和吸附时间对IgG纯度和回收率的影响,并采用响应面试验设计确定最佳分离纯化条件。结果表明,随着结合液pH增大,IgG纯度和回收率都是先增加后急剧降低,最佳pH为6.65;随着结合液NaCl浓度增加,IgG纯度先增大后降低,但是IgG的回收率保持不变,最佳NaCl浓度为0.5mol/L;MNPs对IgG最佳吸附时间为2h。该条件下IgG的回收率与纯度分别为90.33%和83.75%。

牛IgG电化学纳米免疫传感器的研制

研制特异性定量检测牛初乳制品及含牛IgG制品中牛IgG含量的电流型纳米免疫传感器。以成膜性及生物相容性良好的壳聚糖为媒介连接纳米金于玻碳电极,以比表面积大、吸附能力强、生物相容性好的纳米金固定兔抗牛IgG-HRP。通过循环伏安法及交流阻抗法表征电极组装各个过程的电化学特性,利用计时电流法测定PBS稀释的标准牛IgG。结果表明免疫前后稳定电流的变化率与标准牛IgG质量浓度的对数在0.1～10000ng/mL范围内线性相关,相关系数r=0.9976。该传感器稳定性及重现性良好,操作简单方便,成本较低,可用于含牛IgG制品中牛IgG含量的特异性定量检测。

荧光探针法研究牛血清白蛋白和免疫球蛋白的表面疏水特性

利用8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS)荧光探针法,测定了牛血清白蛋白(BSA)与牛免疫球蛋白(bIgG)的表面疏水性,探讨了pH、温度、添加盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、盐酸胍和辛酸钠(NaCA)对蛋白表面疏水性指数S0的影响。实验表明,对于阴离子型荧光探针ANS,pH对S0测定的影响显著,选择pH略高于蛋白等电点比较合适。温度对两种蛋白S0的影响不同,从50℃升至80℃,BSA表面疏水性降低,bIgG表面疏水性升高。添加盐促使蛋白的表面疏水性增强,相比BSA,bIgG增加幅度较大。不同变性剂对两种蛋白S0的影响也不同,与变性机制、蛋白疏水特性及分子结构有关。添加NaCA对两种蛋白S0影响存在显著差异,随着NaCA浓度升高,BSA的S0值减小,而bIgG则维持基本不变,这与疏水层析分离过程的NaCA影响相一致。结果表明,ANS荧光探针法可用于考察不同溶液条件对蛋白质分子表面疏水性的影响,研究特定添加剂-蛋白质间疏水相互作用。

人类免疫球蛋白制造步骤中去除牛海绵状脑病因子的研究

背景和目的 如何在血浆类制品生产过程中清除克-雅氏病变体因子(vCJD)仍不清楚。本研究以一株牛海绵状脑病(BSE)因子作为vCJD模型,测定静脉内免疫球蛋白(IVIG)生产过程中的特定步骤去除BSE因子感染性的效果。材料和方法鼠传代BSE毒株(301Ⅴ株),由被感染的脑组织中提取,制备成为微粒体组分,作为三组实验中的接种原料。分别考察Ⅰ+ Ⅲ组分沉淀,硼硅酸盐微纤维过滤以及蔡氏(Seitz)