牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85%(6/323)、BCoV阳性检出率14.24%(46/323)、BRV阳性检出率57.89%(187/323)、BoAstV阳性检出率0.31%(1/323)、BoNeV阳性检出率10.84%(35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48%(8/323)、BToV阳性检出率4.64%(15/323)、BKoV阳性检出率11.76%(38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。

牛冠状病毒刺突蛋白研究进展

牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)是一种能感染牛肠道、呼吸道引起新生犊牛腹泻、成年牛冬季痢疾和各年龄段的牛呼吸道疾病的重要病原体,严重危害着养牛业的发展。刺突(spike, S)蛋白是该病毒主要的结构蛋白和免疫原性蛋白,在病毒初始感染和诱导保护性免疫中发挥重要作用。本文就该病毒刺突蛋白的结构特征、生物学功能及应用研究、免疫原性、变异原因和潜在双受体系统的最新研究进展做一阐述,期望为新型疫苗研制和靶点治疗药物开发提供科学依据,以便制定快速有效的安全防治对策应对预出现的新毒株。

牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P<0.01);若以中和试验为标准,ELISA的敏感性为100.00%(31/31),特异性为88.89%(8/9),与血清中和试验具有很强的一致性(κ=0.925,P<0.01)。采用该方法对303份牛血清进行检测,BCoV阳性率为74.91%。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。

我国部分省份牛冠状病毒HE基因遗传变异分析

2020-2023年收集我国14个省份78个临床发病牛群的肛拭子、粪便、组织等样品1819份,用实时荧光RT-PCR方法进行牛冠状病毒(BCoV)检测,并选取部分核酸阳性样品进行HE基因全长的扩增、测序与遗传变异分析。78个发病牛群中,BCoV阳性场占56.41%,共获得35条HE基因全长序列,与参考序列相比,核苷酸同源性为97.0%~100.0%,氨基酸同源性为97.0%~99.8%。系统进化分析表明,BCoV毒株HE基因在进化上呈现典型的地域性特点,亚洲毒株和美国毒株进化上较为接近,而欧洲毒株位于另一个分支,所测毒株与中国参考毒株处于亚-美型毒株分支中,位置相对较为集中。所测35个HE序列中,有34个没有发生插入或缺失突变,来自宁夏的BCoV/NX13/CHN/2023毒株其HE基因存在12个核苷酸的插入突变,证实了BCoV HE基因插入变异株在我国的存在。基因重组分析显示,该毒株与BCoV/HeB120/CHN/2021的HE基因可能发生了重组,预测重组值分别为0.797和0.759。说明了我国部分省份临床发病牛群BCoV感染及BCoV HE基因的遗传变异,为明晰我国BCoV流行毒株分子特征提供参考。

内蒙古牛冠状病毒全基因组测序与遗传进化分析

【目的】了解内蒙古地区牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)流行毒株的全基因组特征和遗传进化情况,为有效防控BCoV感染提供参考。【方法】本研究对疑似感染BCoV的犊牛脾脏进行宏病毒组测序和步移RT-PCR扩增,获得BCoV全基因组序列,并对其进行生物信息和遗传进化分析。利用Oligo 7.0软件设计特异性引物扩增S基因,并对其进行遗传进化、氨基酸序列变异、抗原表位预测及三级结构预测分析。【结果】本研究从疑似感染BCoV的犊牛脾脏中成功获得大小为30971 bp的BCoV全基因组序列,NCBI登录号为PP352170.1,该全基因组核苷酸序列与BCoV爱尔兰株ABGEB0-62相似性最高,为99.2%,并与该株亲缘关系最近,同时与BCoV法国株BCoV_2014_13和挪威株Nes_2012-01-03属于同一进化分支;扩增出的S基因核苷酸长度为4092 bp,与BCoV爱尔兰株ABGEB0-62 S基因序列亲缘关系最近,处于同一进化分支,但核苷酸序列与BCoV内蒙古株NMG1 S基因相似性最高,为99.4%;S基因编码的氨基酸与Mebus株比对发现,有15个氨基酸变异位点(S1亚基12个,S2亚基有3个),其中变异的氨基酸残基154、260、499-520、718、1192、1344位氨基酸处于抗原表位区,并导致S蛋白三级结构发生改变。【结论】本研究利用宏病毒组测序和基因组5′-端步移RT-PCR法获得内蒙古BCoV株全基因组序列,其S蛋白抗原表位区氨基酸位点发生变异和三级结构改变,预示S蛋白抗原性发生了改变;S1亚基的多态性区域氨基酸位点的变异预示S蛋白的致病性发生变化。

一例牛冠状病毒引起犊牛急性腹泻的分子生物学诊断与治疗

2020年8月初,江西省宜春市某牛场4~5月龄犊牛暴发以急性腹泻、食欲减退并伴随便血为主要症状的传染性疾病,使用抗菌药物和驱虫药未能有效控制病情。为了确定腹泻的病原及其分子特征,试验无菌采集腹泻犊牛粪便样本,对牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRoV)、口蹄疫(FMDV)病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛流行热病毒(BEFV)5种常见导致牛腹泻的病原进行PCR检测,并对检测到的病原PCR产物进行序列分析,最后选用适宜的方案进行对症治疗,观察治疗效果。结果表明:腹泻犊牛粪便样本均检测出BCoV,其他病原均未检出。所测序列与BCoV N基因的核苷酸相似性在97.2%以上,将检出的病原命名为BCoV-JX。BCoV-JX株N基因的氨基酸序列与12株BCoV参考株的N基因氨基酸序列相似性均在98.9%及以上,其中与美国牦牛源分离株7-16-23、中国牦牛源分离株SWUN/A1/2018和我国奶牛源分离株DB2的N基因氨基酸序列相似性最高,均为99.8%。BCoV-JX株与美国牦牛源分离株7-16-23和我国牦牛源分离株SWUN/A1/2018处于同一分支上,亲缘关系较近。经补液、注射中药强心剂和抗菌药物,病牛逐渐康复,未见新增病例。说明导致该养牛场犊牛腹泻的病原为BCoV,该BCoV流行株可能由牦牛源BCoV变异而来。

牛冠状病毒S和HE蛋白研究进展

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犊牛腹泻、牛的呼吸道感染和成年牛冬痢的一种病原,主要通过粪-口感染和呼吸道气溶胶传播。研究表明,BCoV在亚临床感染的成年牛体内可持续存在,这可能是BCoV在牛群中广泛存在且能长期循环的原因。因此,BCoV的流行会对集约化牛场造成巨大的经济损失,BCoV的防控形势极其严峻。BCoV S蛋白包含主要的抗原位点,可与宿主表面的唾液酸(SA)结合,且S蛋白参与病毒与宿主细胞的吸附和膜融合过程,能促进宿主产生有效的中和抗体。BCoV HE蛋白具有乙酰酯酶活性和血凝活性,能与S蛋白协同附着于细胞表面并启动感染。S和HE蛋白均在病毒的组织或宿主嗜性及毒力等方面发挥重要作用,这些作用也为进一步开展BCoV病原研究及后续疫苗和药物的研制提供参考。笔者重点阐述了BCoV S和HE蛋白的分子结构及功能,以及BCoV基于S和HE蛋白的受体识别作用(包括利用N-乙酰-9-O-乙酰神经氨酸为糖结合受体,利用人类白细胞抗原Ⅰ类分子为蛋白结合受体)。受体识别是冠状病毒感染和致病的重要决定因素,也是宿主免疫监视和人类干预策略最重要的靶标之一。因此,充分了解BCoV S和HE蛋白的结构功能和受体识别作用对于了解病毒的致病机制及抗病毒药物、疫苗的研发具有重要意义。

牛冠状病毒感染新生犊牛肺上皮细胞模型的建立

[目的]牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是犊牛腹泻和上呼吸道疾病的主要病原,目前缺少敏感的适合BCoV体外培养的本动物细胞,限制了BCoV致病机制的深入研究。因此,本研究拟从犊牛肺脏组织中分离出牛肺上皮细胞(bovine lung epithelial cell,BLEC)建立BCoV体外感染本动物细胞模型。[方法]采用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原蛋白酶两步酶消化法对新生犊牛肺脏组织进行肺上皮细胞初步提取,再利用上皮细胞贴壁时间不同的差异贴壁法纯化BLEC。通过间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)检测纯化后细胞中标志细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK-18)的表达来鉴定BLEC,并通过PCR方法对细胞进行病原纯净性检测,包括牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)、BPIV5、牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、BCoV和支原体(Mycoplasma)。通过PCR和IFA检测BCoV对BLEC的易感情况,并绘制BCoV在BLEC上的一步生长曲线。[结果]分离纯化培养的BLEC形态均匀稳定、呈菱形或砖块状,无常见病原BRV、BVDV、BPIV3、BPIV5、IBRV、BCoV和支原体污染,上皮细胞标志CK-18呈阳性表达。犊牛腹泻来源的BCoV HLJ-325毒株感染BLEC 24 h后可观察到明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);PCR能扩增出BCoV N基因;IFA结果显示,BCoV感染BLEC呈现特异性红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测BCoV含量建立病毒生长曲线,BCoV在感染BLEC后20 h时病毒载量最高,为4.46×10^(5)拷贝/mL。[结论]本研究成功分离制备了BLEC,证明BCoV易感染BLEC,构建了BCoV体外感染BLEC模型,为研究BCoV引起牛呼吸道疾病的致病机制奠定基础。

牛冠状病毒、牛轮状病毒和致病性大肠杆菌混合感染致犊牛腹泻的研究

为了明确新疆石河子某规模化奶牛场犊牛腹泻病死率较高的原因。本研究对腹泻犊牛的粪样及病死犊牛肠道内容物进行病原检测,并对分离菌株进行毒力基因检测、耐药基因检测、动物致病性试验及药敏试验。最终明确病因主要由牛冠状病毒(BCoV)和牛轮状病毒(BRV)和大肠杆菌混合感染引起。药敏试验表明,分离到的大肠杆菌对28种抗生素产生了严重的耐药,仅对多粘菌素和呋喃妥因敏感,并且发现该菌同时携带2种毒力基因和10种耐药基因。本研究分离的一株大肠杆菌携带有丰富的耐药基因,具有多重耐药性,为该奶牛场上临床治疗加大了难度。而本试验结果为该养殖场提供科学的临床药物指导,为该牛场治疗此次犊牛腹泻提供了依据,同时为新疆犊牛腹泻混合感染的防控提供了病例参考和技术资料。

牛冠状病毒病的流行特点、诊断与防治

牛冠状病毒是一种对牛群健康和生产造成严重影响的病原体,该病毒在全球范围内有广泛的流行和分布,可能对牲畜、野生动物和人类健康构成威胁。牛冠状病毒感染引起的症状包括犊牛腹泻、成年牛冬季痫疾和牛呼吸道疾病,严重影响了牛养殖业的健康发展。该文全面介绍牛冠状病毒的流行特点、诊断方法和防治措施,以期为牛冠状病毒病的临床诊治工作提供参考。

牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒四重一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)的方法,根据BVDV 5'UTR基因、BEV 5'UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。

牛冠状病毒河北流行株部分基因全序列测定及分子特征分析

牛冠状病毒(BCoV)是引起新生犊牛腹泻的重要病原之一,在世界范围内广泛分布,严重影响养牛业的健康发展。为确定河北省BCoV流行毒株的基因遗传进化特征,本研究对从河北省某牛场腹泻犊牛的粪便和肠内容物中鉴定出的1株BCoV流行毒株(BCoV/CH/HB-BD/2019),进行了S、N、HE基因的全序列扩增及测定,并与GenBank中的51株牛冠状病毒参考株进行了各基因的同源性和遗传进化分析。结果显示:BCoV/CH/HB-BD/2019与BCoV参考株相比,S基因具有2个独特的氨基酸变异位点(N311S、D1276Y);在HE基因中HB-BD株出现2个独特的氨基酸变异位点,分别为G400V、D423H;虽然在基因的重组分析中,HB-BD株HE基因序列并没有检测到基因重组信号,但通过检测我们发现,HB-BD株HE基因序列为其新疆毒株(KU886219.1)推测的主要亲本毒株;进化分析发现,BCoV HB-BD株与人冠状病毒(HCoV-OC43)均属于β类冠状病毒属2a亚群,且同源性高达96.0%,而正在全世界范围内传播的SARS-CoV-2属于β类冠状病毒属2b亚群病毒,BCoV与SARS-CoV-2属于同一冠状病毒属不同亚群。本研究为牛冠状病毒病的防控以及进一步揭示冠状病毒之间的关系提供了依据。

牛冠状病毒交叉引物扩增快速检测方法的建立

牛冠状病毒(BCoV)引起犊牛腹泻,对养牛业造成极大危害。本研究采用交叉引物扩增(CPA)方法和核酸检测装置相结合,建立了BCoV的可视化快速检测方法。结果表明,CPA体系Mg2+最佳物质浓度为2.0 mmol/L,甜菜碱最佳物质浓度为0.4 mmol/L,d NTPs最佳物质浓度为0.6 mmol/L,Bst DNA聚合酶最佳浓度为1.5 U/μL,60℃为最佳反应温度,60 min为最佳反应时间。采用CPA BCoV-N反应体系同时检测沙门菌、大肠埃希菌、弯曲杆菌、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒等犊牛腹泻相关病原,层析试纸条检测显示只有牛冠状病毒呈现检测线,未出现交叉反应。结果显示,CPA BCoV-N具有较高的特异性,CPA检测BCoV不需要昂贵的PCR仪器,简单的水浴或培养箱即可完成DNA扩增,封闭式核酸检测装置避免了气溶胶污染,对结果的判断更加直观客观,是一种简便、快速、灵敏的BCoV检测方法。

新疆南疆牛冠状病毒BCV-Aks-01株分离及基因型鉴定

将疑似感染牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)病死犊牛的粪便样品,滤菌处理后接种于HCT-8细胞,盲传数代,出现细胞病变后收获细胞液。提取病毒RNA,依据NCBI登录的牛冠状病毒高度保守N基因设计1对特异性引物,对N基因进行RT-PCR扩增、测序及序列分析。结果显示,BCV-Aks-01毒株与牛冠状病毒参考株N基因核苷酸同源性为97.5%~98.6%,同BCoV参考毒株Mebus同源性为97.8%,N基因遗传进化树表明,BCV-Aks-01毒株与BCoV参考株亲缘关系较近,处于遗传进化树中同一分支上,属于冠状病毒Betacoronavirus,证实该分离株为牛冠状病毒。

吉林省肉牛冠状病毒感染状况调查及分析

旨在全面了解牛冠状病毒(BCoV)在吉林省肉牛群的流行情况,选择吉林省东中西部地区的12个县市的规模化、养殖合作社、家庭型养殖户等牛场在不同季节采集血液、鼻拭子、粪拭子及临床病死牛组织脏器,采用血清学及分子生物学诊断检测技术,对BCoV进行流行病学调查,了解BCoV在该吉林省部分地区的流行情况。共采集临床血清样品1298份,粪便样品、肝、肺、脾、气管等组织样品462份,应用商品化BCoV抗体检测试剂盒检测血清抗体和纳米PCR新型检测技术对临床样品进行PCR检测,并对核酸检测出的阳性结果测序分析。结果显示BCoV抗体血清阳性率为1.08%,粪便、肝等临床样品阳性率21.10%。经测序分析调查地区BCoV流行株与我国四川流行株相似性达99%以上。本研究对吉林省中部地区BCoV流行情况进行了全面调查,丰富了牛冠状病毒的流行病学调查数据,为指导牛冠状病毒的防控工作奠定了基础。

新疆地区牛冠状病毒的分子流行病学调查

牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)是造成犊牛腹泻的主要病原之一。新疆养牛业发展迅速,国内外引入品种数量日益增多,BCoV感染呈上升态势,但对其流行现状与规律缺乏全面了解。本研究于2020—2022年对新疆南、北疆养牛业主产区BCoV感染的流行情况进行了两年跟踪调查,共采集犊牛腹泻粪样本652份,采用RT-PCR方法进行了BCoV检测。对分离鉴定到的毒株进行了遗传进化分析。结果发现,BCoV总阳性率23.93%(156/652)。BCoV感染呈季节性变化,冬季为主要感染季节,检出率高达50.85%。南疆地区BCoV发病率高于北疆地区。与奶用犊牛相比,肉用犊牛更易感染。遗传进化分析表明:本试验分离到的BCoV毒株暂命名为BCoV/China/XJ-CJ/2022,该毒株的S基因与2018年毒株MN982199.1进化关系最近,N基因与2018年毒株MK095169.1BCOV-China/SWUN/LN4/2018进化关系最近,M基因与2017年毒株MK095148.1 China/SWUN/SC1/2017进化关系最近,HE基因与2017年毒株MK095136.1 BCOV-China/SWUN/SC2/2017进化关系最近。使用软件分析BCoV/China/XJ-CJ/2022与其它国家出现的BCoV毒株之间未出现基因重组现象。经5个结构蛋白的核苷酸和氨基酸相似性分析,发现其基因依然与中国国内本土毒株FJ938064.1_E-AH187-TC相似度最高,分别最低达到91.50%和96.70%。调查结果表明,BCoV在新疆规模化牛场呈现出的季节、地域和品种间的感染差异性可为精准防控策略的制定提供数据支撑。

广西河池地区牛肠道病毒和牛冠状病毒流行病学调查及遗传变异分析

为了解广西壮族自治区河池地区牛肠道病毒(BEV)和牛冠状病毒(BCoV)的流行情况及毒株序列特征,本试验应用TRIzol法抽提核糖核酸(RNA),采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对2021—2022年广西河池各地区采集得到的422份粪便样品进行病原检测及遗传变异分析。结果显示,广西河池地区BEV的检出率为3.23%~19.51%,BCoV的检出率为2.44%~4.62%,BEV和BCoV混合感染率为2.44%~4.44%。按照不同品种牛群对BEV和BCoV检测结果进行分析,结果显示,西门塔尔杂交牛BEV感染率为13.99%,BCoV感染率为2.07%;本地黄牛BEV感染率为9.00%,BCoV感染率为0.95%;杂交水牛BEV感染率为33.33%,BCoV未发现感染;安格斯牛BEV和BCoV均未发现感染。按照不同年龄对BEV和BCoV检测结果进行分析,结果显示,0~180日龄BEV感染率为22.11%,BCoV感染率为4.21%,大于180日龄牛群BEV感染率为7.95%,BCoV感染率为0.61%。按照不同养殖模式对牛群BEV和BCoV检测结果进行分析,结果显示,农户养殖BEV感染率为12.06%,BCoV感染率为1.42%,合作社养殖BEV感染率为9.29%,BCoV感染率为1.43%。遗传变异分析结果显示,广西河池地区存在E、F型2种BEV感染,检出E型BEV 21份,检出F型BEV 26份。本试验首次揭示了广西河池地区BEV和BCoV的流行病学调查数据,为广西乃至全国牛肠道病毒和牛冠状病毒净化防控提供了理论参考数据。

牛冠状病毒病诊断及防治的研究进展

牛冠状病毒是套式病毒目冠状病毒科Beta冠状病毒属的成员,该病毒根据被感染动物的年龄、感染途径等不同而引起新生犊牛腹泻、成年牛冬季痢疾和呼吸道症状等3种临床表现。牛冠状病毒病自发现至今,每年在全球范围均具有较高的发病率,因影响患牛生长发育、治疗与预防困难等给养牛业带来较大损失。文章对牛冠状病毒病的病原学、流行病学、致病机制、鉴别诊断和预防等方面的研究进展进行综述,旨在加强对牛冠状病毒病的认知,为该病的防控提供参考。

内蒙古地区牛冠状病毒的分离鉴定及S1基因遗传进化分析

为了对内蒙古地区患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛冠状病毒(BCoV)的种质资源和流行病学数据,试验采用PCR扩增、间接免疫荧光试验、增殖动态检测、透射电镜观察等方法确定9份新生犊牛腹泻粪便样本的病原学特征,同时通过序列比对分析与GenBank中具有代表性的BCoV S1基因组序列的同源性,利用MEGA 7.0.14软件构建S1基因组系统进化树。结果表明:9份样本中有2份为BCoV N基因阳性,PCR扩增得到大小约为730 bp的目的条带;用阳性样本接种HRT-18G细胞并进行3次传代培养,可见细胞出现以变圆、融合形成合胞体、融合细胞脱落为主要特征的典型细胞病变;分离株能够与兔抗BCoV N蛋白的多克隆抗体发生特异性反应,透射电镜观察可见有囊膜、表面有纤突、直径约为120 nm的病毒粒子;将分离获得的BCoV毒株命名为HM-XC,该分离株感染HRT-18G细胞的病毒含量为1×10^(5.75)TCID_(50)/0.1 mL;分离株HM-XC S1基因的核苷酸序列与我国青海省牦牛源毒株BCoV Yak/BCoV-China/QH1的相似性最高,为99.61%,与近年来辽宁省流行毒株的相似性为96.4%~99.0%,与美国经典参考毒株BCoV Mebus的相似性较低,为96.3%;与相似性最高的Yak/BCoV-China/QH1毒株相比,分离株HM-XC的S1蛋白存在7个氨基酸突变,分别是H115D、S186W、Y509H、V528A、N531D、L563S和I640T。说明内蒙古地区牛场中已有BCoV的流行,并且在犊牛腹泻粪便中分离获得BCoV内蒙古流行毒株,分离株具有我国新流行BCoV株的序列特征。