原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性

摘要凝乳酶能够专一性裂解κ-酪蛋白，是制造干酪的关键酶。运用大肠杆菌表达系统对牛凝乳酶原进行了原核表达和初步纯化，活化重组凝乳酶原及测定凝乳活性，对重组凝乳酶的酶学特性进行分析。结果表明i大肠杆菌表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的66．3％，每升培养液可纯化约200mg的重组凝乳酶原，活化后的凝乳酶活力可达600000SU／g。经测定凝乳酶最适作用温度为57～62℃，并在pH2～7、低于40℃的温度范围内稳定。金属离子中Al3＋，Fe3＋和Cu2＋能显著增强酶活；胃蛋白酶抑制剂pepstatinA对酶有明显的抑制作用。

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达

以Tac为启动子构建了牛凝乳酶原B基因表达质粒pTaAC,转化大肠杆菌JM105,对数生长期加入0.1mmol/L IPTG能明显诱导凝乳酸原的产生。基因表达除受IPTG的影响外,也受温度的调节控制。在30℃培养,IPTG存在时,凝乳酶原产量极低;在42℃无IPTG的条件下,基因也能表达。按电泳扫描计算凝乳酶原蛋白占细胞可溶性总蛋白量的12—19%,按ELISA法测定凝乳酸原产量为80—100mg/L,经变性、复性及酸化有活性的凝乳酶产量为14—20mg/L。

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。

牛凝乳酶原基因在乳酸乳球菌中的表达

【目的】利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the NIsin Controlled gene Expression system,NICE)表达牛凝乳酶原。【方法】从克隆载体pS19-PPC中获得牛凝乳酶原基因,将该基因与表达载体pNZ8148连接并电转化乳酸乳球菌NZ9000,转化子经酶切、PCR和测序鉴定后,用nisin进行诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western blot鉴定,表达产物纯化后检测凝乳活性。【结果】重组牛凝乳酶原与天然牛凝乳酶原比较,其分子量大小、免疫性质、生物活性和抑制剂敏感性没有发现显著差异,其凝乳活性可达2×103IMCU/mL。【结论】在乳酸乳球菌中表达了具有凝乳活性的牛凝乳酶原,同时乳酸乳球菌作为发酵剂和凝乳酶产生菌双重角色的实现,为奶酪加工提供了新思路和新方法。

牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母中的表达

凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,为获得高活性的凝乳酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母为宿主,首次对经密码子优化的牛凝乳酶原基因进行表达。利用DNAWorks3.0软件辅助设计,用两步PCR法合成了小牛凝乳酶原基因(GenBank Accession No.AA30448)。将该基因插入酵母表达载体pKLAC1,构建了重组载体pKLAC1-Prochy,并用电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌chy1。该菌株可分泌表达牛凝乳酶原,经SDS-PAGE分析,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41kDa,符合预期大小,酸化处理后为36kDa,证明可以正确自我剪切。液体培养96h后,酶活最高达到99.67SU/mL。分别以半乳糖和葡萄糖为碳源的条件下表达,其酶活性差异不大,说明在发酵期间,可以不经过半乳糖诱导即可产生高水平的牛凝乳酶原产物。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。