牛源副结核分枝杆菌MAP3732c基因的原核表达与多克隆抗体的制备

为表达副结核分枝杆菌MAP3732c蛋白,研究构建原核表达质粒pET28a-MAP3732c,诱导表达鉴定后采用His标签亲和层析纯化获得MAP3732c重组蛋白,多次免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA方法检测其抗体效价。结果表明,成功构建克隆重组质粒T1-MAP3732c与表达重组质粒p ET28a-MAP3732c;在IPTG终浓度为0.5 mmol·L^(-1)、37℃条件下成功诱导MAP3732c重组蛋白表达;SDS-PAGE结果表明,MAP3732c重组蛋白大小约为28 ku,且以包涵体形式存在;Western blot鉴定结果显示,重组蛋白与His抗体和牛源副结核病阳性血清均有良好免疫反应、阴性血清无非特异性结合;ELISA方法检测结果显示,抗MAP3732c多克隆抗体效价为1:204800。研究为副结核分枝杆菌MAP3732c蛋白免疫原性分析及副结核病检测方法建立提供理论参考。

牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立

为建立牛副结核分枝杆菌(MAP)的快速检测方法,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以MAP的IS900基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了MAP特异性的LAMP快速检测方法。经反应条件优化,检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有良好的特异性,最低见测量为0.53 pg;与其他病原菌无任何交叉反应。临床样品检测与行业标准的符合率为100%。该LAMP检测方法可以用于MAP的常规检疫。

副结核分枝杆菌MAP0862蛋白的表达及在间接ELISA中的初步应用

本研究的目的是探索副结核分枝杆菌特异性蛋白MAP0862在牛副结核病血清学诊断中的作用,建立牛副结核病特异性ELISA诊断方法。将通过原核表达获得的副结核特异性蛋白MAP0862纯化并定量后作为包被抗原,经过一系列条件优化后初步建立了牛副结核病间接ELISA诊断方法。使用牛副结核阳性血清、牛布病阳性血清、牛结核阳性血清、卡介苗免疫牛血清、牛大肠杆菌阳性血清以及健康阴性牛血清对该方法的验证表明其具有良好的特异性。使用该方法对300份临床血清进行检测,结果表明该方法与IDEXX副结核检测试剂盒的符合率为94.3%。基于副结核特异性蛋白质MAP0862建立的间接ELISA诊断方法能有效检测牛副结核病。

禽分枝杆菌副结核亚种map0862基因与map2154c基因的串联重组表达

以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c。将融合基因与原核表达载体pET32a(+)连接,构建了重组质粒pET0862-2154c。将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导后对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明,表达的重组蛋白map0862-2154c的分子质量为76 ku,可用于建立诊断副结核病的ELISA。

牛副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌F 57基因保守区域设计合成1对引物,建立了副结核分枝杆菌特异的SYBR Green I染料实时荧光定量PCR快速检测方法。以牛副结核分枝杆菌pMD-F57重组质粒为标准品,建立标准曲线,其相关系数为0.999。该方法对副结核分枝杆菌标准菌株的检测呈阳性反应,对结核分枝杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌等常见微生物均呈阴性反应。该方法检测灵敏度可达10个基因拷贝,比常规PCR检测灵敏度提高100倍。重复性检测显示,该方法的组内变异系数低于0.31%,组间变异系数低于0.79%。所建立的方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,可用于牛副结核病的诊断和监测。使用所建立的牛副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR方法对收集自新疆地区规模化牛场的85份粪便样品和116份牛乳样品进行检测。结果显示,新疆地区规模化牛场粪便阳性率为9.41%,奶样阳性率为5.17%,表明本地区奶牛养殖场存在一定程度的副结核分枝杆菌感染,需引起相关部门的重视。

副结核分枝杆菌map0862基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为探索MAP0862蛋白在分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,研究构建了MAP0862的原核表达map0862-pET32a(+)质粒,并对其进行了诱导表达。以副结核分枝杆菌P10基因组DNA为模板,经PCR方法扩增副结核分枝杆菌map0862基因片段,将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中。将重组子转化到大肠杆菌BL21(DE3),在E.coli中诱导表达带组氨酸标签的map0862-pET32a(+)的融合蛋白。结果显示,经IPTG诱导表达出约55 kD的融合蛋白,用副结核阳性血清进行Western blot检测,证明MAP0862重组蛋白具有良好的免疫原性。

副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究

为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。

牛副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因保守区域序列设计合成1对特异性引物,建立了一套SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测牛副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)的方法。以实验室构建的牛副结核分枝杆菌pMD-ISMav2阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线,其相关系数为0.999。以构建的标准品为模板,进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法检测布氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌DNA均为阴性;最低可检测到相当于每微升1.96×101拷贝数的标准品阳性质粒。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感和快速等优点,可用于牛副结核杆菌病的监测。

表面展示副结核分枝杆菌抗原MAP3007的大肠杆菌活载体疫苗株的构建与免疫效力评价

为构建表面展示副结核分枝杆菌抗原MAP3007的大肠杆菌活载体疫苗株,本研究将冰核蛋白(INP)作为展示平台,将目的基因克隆于构建的pET-INP表面展示载体中,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对目的蛋白的表达与定位进行检测。将110只雌性BALB/c小鼠随机分为PBS组(30只),INP-28a对照组(30只),INP-MAP3007重组菌免疫组(30只),空白未攻毒组(20只),其中对照组INP-28a与重组菌INP-MAP3007免疫组以5×10~5cfu/200μL/只剂量分别免疫INP-28a空菌与INP-MAP3007重组疫苗,PBS组注射等体积PBS,3免后以5×10~8cfu/只进行副结核分支杆菌K-10株攻毒试验,空白未攻毒组不做处理,通过检测各组小鼠抗体水平、细胞因子、CD4^+和CD8^+T细胞亚群、增重率以及肠、肝脏和脾脏的病理损伤综合评价疫苗的免疫效果。结果显示,目的蛋白MAP3007正确表达且定位于细菌表面;经3次免疫后疫苗组与其他对照组相比能产生较高的抗体水平(p<0.001);攻毒后与其他对照组相比,疫苗组小鼠细胞因子IFN-γ和IL-4极显著升高(p<0.001),同时抗炎性细胞因子IL-10降低;疫苗组CD4^+T、CD8^+T淋巴细胞数量极显著增加(p<0.001),且疫苗组小鼠体重增长速度与未攻毒组基本一致;病理组织学结果发现疫苗组各器官病变情况相对较轻或无显著病变。上述结果表明表面展示活载体疫苗能够诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫进而提供较好的免疫保护,且可以降低其病理损伤程度,减缓病程。本研究为新型副结核杆菌疫苗的研制奠定了基础。

副结核分枝杆菌MAP0862蛋白的重组表达及抗原性分析

为了验证MAP0862蛋白在副结核分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,试验以从发病山羊消化道病料中提取的副结核分枝杆菌基因组DNA为模板,克隆MAP0862基因并构建重组表达载体pET28a-MAP0862,然后对其进行诱导表达及Western-blot分析。结果表明:检测到的羊副结核分枝杆菌MAP0862基因与GenBank中K10菌株基因完全相同;重组表达载体pET28a-MAP0862经IPTG诱导表达出约40 ku的目标蛋白,与预期结果相符;Western-blot对比分析显示, MAP0862蛋白只与羊副结核阳性血清发生显色反应。说明MAP0862蛋白具有良好的免疫反应原性和特异性。

牛副结核病的病原学和防控研究进展

牛副结核病是一种由副结核分枝杆菌引起的主要影响反刍动物的慢性消耗性疾病,也是一种潜在的人兽共患病。该病可导致腹泻、渐进性消瘦,甚至死亡,增加生产成本,是影响全球奶牛业最严重的传染病之一。牛副结核病难以诊断,病原分离周期长,我国相关研究报道较少且存在误区。因为潜伏期长,患病动物在感染早期体液免疫水平低,排菌量低,导致细菌分离培养和抗体检测都很难做出诊断;即使最灵敏的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法也只能在部分感染动物的粪便样品中检出副结核分枝杆菌;皮肤变态反应试验和γ干扰素释放试验等方法易受其他结核分枝杆菌的影响,也难以普及。本文旨在提炼性的阐述牛副结核病的病原学研究进展,总结其流行病学和防控策略等信息,以期为该病的预防和控制工作提供参考。

副结核分支杆菌MAP0862蛋白的表达及临床应用

本研究以腹泻牛粪便基因组DNA为模板,扩增MAP0862基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862,通过原核表达系统表达His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白,经纯化后制备兔源高免血清,建立ELISA特异性检测方法,最后将纯化蛋白和ELISA方法用于牛副结核病临床样品检测,并对检测数据进行分析。结果表明,以MAP0862蛋白为检测原建立的ELISA检测方法在临床样品检测中具有较高的特异性和敏感性,说明MAP0862蛋白适用于副结核病抗体检测。本研究建立的ELISA检测方法可有效检测临床样品中副结核病的感染。

副结核分枝杆菌MAP0862-1595融合蛋白的表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立基于重组蛋白MAP0862-1595的山羊副结核病诊断方法,本研究筛选副结核分枝杆菌的2个基因MAP0862与MAP1595,通过重叠延伸PCR技术将获得MAP0862-1595融合基因与重组质粒载体pEASY-T1及表达重组质粒载体pET30a连接,通过Western-blot方法验证MAP0862-1595重组蛋白的反应原性,通过以纯化后的重组蛋白MAP0862-1595作为包被抗原和反应条件优化构建间接ELISA法。结果显示:重叠延伸PCR扩增出MAP0862和MAP1595融合基因片段,长度为1601 bp;成功构建克隆重组质粒pEASY-MAP0862-1595和表达重组质粒pET30a-MAP0862-1595;MAP0862-1595重组蛋白大小约为70 kDa,主要以包涵体形式存在;Western-blot验证该蛋白能与副结核分枝杆菌阳性血清特异性结合反应。将纯化后MAP0862-1595蛋白以1μg/孔包被,一抗血清以1∶400稀释,以5%脱脂乳进行封闭,二抗以1∶50000稀释,成功构建ELISA检测法。ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为副结核病的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。

牛副结核病的危害及其防控措施

由副结核分枝杆菌引起牛的副结核病常导致感染牛的慢性增生性肠炎,以及体重、产奶量等生产性能下降,给畜牧业带来了严重的经济损失,目前尚无有效治疗药物。人们常采用不同的检测技术定期对牛群进行监测、淘汰活动带菌期的牛、对牛群进行疫苗接种、采用生物安全防控等措施比较有效地避免了副结核分枝杆菌在牛群中的传播。文章主要从副结核分枝杆菌背景,牛副结核病的危害及防控措施三个方面进行了综述,以期为牛副结核病的防控提供思路。

奶牛副结核病流行牛场的处置方案分析

为协助新疆某副结核病严重流行的奶牛场抑制该病的流行,2014-2015年间采用副结核分枝杆菌(MAP)间接ELISA抗体检测试剂盒对该牛场的965头牛进行了4次血清抗体检测,并通过淘汰部分阳性牛控制该病的流行。结果显示,在两年内累计检测出297头阳性牛,检出率为30.78%(297/965)。首次检测发现104头阳性牛,检出率为13.51%(104/770)。淘汰处理后,间隔3个月再次检出2.91%(19/652)的阳性牛,再次淘汰阳性牛后进行了两次监测,其中间隔11个月时检测阳性率为7.55%(41/543),间隔17个月时检出率为33.33%(171/513)。同时,检测结果显示:抗体阳性牛的检出率随年龄的增加而呈现上升趋势,在4~5岁检出率最高,而0.5~1和7~8岁牛中检出率较低。统计分析发现,在副结核病严重流行的奶牛场开展该病的控制或净化时,检测和主动淘汰的间隔期设置为3个月时的控制效果优于11个月和17个月(P<0.001)。虽本次处置未达到预期目标,但根据检测数据和处置措施效果,结合现有的研究数据,初步制订了牛群副结核病流行程度的划分标准和防控、净化方案。本研究将为牛副结核病的防控提供案例借鉴和防控方案。

牛副结核病及其综合防控

牛副结核病又称牛副结核性肠炎,是由副结核分枝杆菌引起的牛的一种慢性、增生性消化道传染病。患病牛的主要特征为慢性卡他性肠炎、持续性腹泻、渐进性消瘦、生产能力下降,病理变化可见肠黏膜变厚并形成皱襞。早期快速、准确地作出诊断,及时淘汰净化牛群。

牛副结核病诊断技术的研究进展

牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的以牛慢性增生、顽固性肠炎、进行性消瘦及产奶量下降为特征的人畜共患传染病,可给畜牧业造成巨大的经济损失,目前还没有有效的治疗方案。早期快速、准确的诊断,对于预防和消除副结核病、保护人们的身体健康和促进我国畜牧业的健康高效发展具有十分重要的意义。随着研究的深入,针对副结核分枝杆菌的诊断技术不断被开发。本文从病原学、免疫学、分子生物学角度对牛副结核分枝杆菌的诊断技术进行了介绍,以期能够为牛副结核病的快速诊断和深入研究提供参考。

牛副结核分枝杆菌(MAP)MAP3290-1595串联蛋白的原核表达及反应原性检测报告

原核表达纯化牛副结核分枝杆菌MAP3290-1595蛋白,为检测牛副结核分枝杆菌提供了新的材料。笔者通过基因串联融合MAP3290和MAP1595基因,获得MAP3290-1595基因,并使用DNAMAN软件对MAP3290-1595基因序列进行分析;构建重组质粒pET30aMAP3290-1595,将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG诱导目的蛋白表达;使用亲和层析法对目的蛋白进行亲和纯化,从而获得MAP3290-1595蛋白;利用Western Blot方法对该蛋白进行质检。成功表达纯化出MAP3290-1595蛋白。该蛋白大小为43 k Da,浓度为0.430 mg/mL,纯度大于90%。本试验成功获得MAP3290-1595蛋白,利用Western Blot和间接ELISA法检测该蛋白的反应原性,与牛副结核阴性血清反应良好,得出该蛋白具有良好的反应原性,为建立牛副结核分支杆菌检测方法提供材料。

肉牛副结核病的流行特征及防控方法

肉牛副结核病具有潜伏期长、发病初期症状不明显、治愈可能性低、传染性强等特点。在肉牛养殖过程中,需要明确该病的流行病学与临床特征,采用的实验室诊断方法,制定科学可行的防控方案。基于此,本文对该病的流行特点、发病机理、疾病危害等进行了分析,详细介绍了该病的类型、临床病牛的疾病表现、病理剖检学特点和多种实验室诊断方法,提出了防控该病的具体措施,以确保肉牛养殖的经济效益。

肉牛副结核病的诊断及防控方法

肉牛副结核病由副结核分枝杆菌引起的牛的一种慢性消化道传染病,具有潜伏期长、发病初期不明显、治愈可能性低、传染性强等特点。在肉牛养殖过程中,养殖人员要明确该病的流行病学特点、临床症状,以及实验室诊断方法等,以便有效应对该病的发生。本文对该病进行了比较详细的分析,给出了多种实验室诊断方法和防控该病的具体措施,供参考。