牛单纯疱疹病毒Ⅰ型gB基因原核表达载体的构建及蛋白表达

目的:获取牛单纯疱疹病毒Ⅰ型gB基因编码的蛋白。方法:根据GenBank中牛疱疹病毒Ⅰ型VRL27-FEB-2012株囊膜糖蛋白B(UL27)基因,设计并合成一对特异性引物,利用PCR方法扩增gB基因序列的第100～1197bp,将此目的片段其命名为1F8基因,随后将PCR扩增后的1F8基因克隆到pMD18-T载体上,重组质粒命名为pMD18-T-1F8;对构建的重组克隆质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将目的基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,并转化到BL21感受态细胞中,获得的重组表达质粒pET-32a(+)-1F8,再通过双酶切和测序进行鉴定;鉴定正确后,在37℃条件下用终浓度为0.1mM IPTG诱导重组菌4h,取诱导后产物进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定。结果:通过琼脂糖凝胶电泳实验结果表明,在1097bp处出现了目的条带;对pMD18-T-1F8重组质粒的PCR、酶切及测序结果表明,扩增的目的条带为牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因序列;通过SDS-PAGE和Western Blot实验对表达蛋白的鉴定结果显示,在58.6kDa左右出现目的条带,与软件预测蛋白的大小相符,确定为牛疱疹病毒Ⅰ型gB蛋白。结论:研究成功构建了牛单纯疱疹病毒Ⅰ型gB基因部分片段1F8的重组表达质粒pET-32a(+)-1F8,并成功表达1F8蛋白,为后续牛单纯疱疹病毒Ⅰ型单克隆抗体的制备和检测方法的建立奠定了基础。