牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exon)融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

【目的与方法】以纯化的牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exons)融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了检测牛双芽巴贝斯虫血清特异性抗体的新型间接ELISA方法。【结果】方阵试验确定的GST-HSP20抗原的最适包被浓度为5μg/mL,血清最佳稀释倍数为40倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.292,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。HSP20间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与巢式PCR检测方法的阳性符合率为96%。【结论】所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。这是国内首次利用重组蛋白建立的牛双芽巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。

牛双芽巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立

【目的与方法】根据Genbank上登陆的双芽巴贝斯虫HSP20基因设计两对引物,SHSP-P1与SHSP-P2和SHSP-P3与SHSP-P4,以其建立牛双芽巴贝斯虫巢式PCR快速检测方法。【结果】第一次、第二次扩增的退火温度均为57℃,分别扩增出约631和409 bp的条带,与预期的大小相符,而作为对照样本的牛巴贝斯虫、牛环形泰勒虫基因组DNA均无此扩增目的条带出现。将感染双芽巴贝斯虫的全血基因组DNA做10倍递减稀释到106倍扩增时,巢式PCR还能见到目的条带,其灵敏度相当于4.6 pg/mL全血基因组DNA。在对50份疫区牛全血DNA样本检测中,阳性检出率分别为22%(11/50)。【结论】所建立的牛双芽巴贝斯虫巢式PCR方法准确、敏感、特异,可以用于牛双芽巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查,具有重要的临床意义。

牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白基因外显子的克隆与原核表达

从患牛焦虫病的牛全血样品中抽提总RNA,通过设计特异性引物,经RT-PCR扩增牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白20(HSP20)基因的外显子,将其插入pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体PGEX-4T-2-HSP20(exon)。试验结果显示牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已被成功克隆。该基因的外显子序列与国际标准株HSP20外显子的序列存在两个碱基的突变,导致其编码的蛋白质出现了一个氨基酸的变异。测序结果还表明,克隆出的牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已正向插入原核质粒表达载体PGEX-4T-2,成功构建了PGEX-4T-2-HSP20(exon)表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中的得到表达。

牛双芽巴贝斯虫新疆株HSP20基因的克隆和真核表达质粒的构建

通过设计牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白HSP20基因序列的特异性引物,采用PCR方法从疑似"牛焦虫病"的患牛全血基因组中扩增得到699 bp的HSP20基因,将其连入pMD18-T测序、鉴定,再将验证的699 bp的HSP20基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核载体PCDNA3.1-HSP20。经再次测序、鉴定后,尾静脉注射小白鼠进行HSP20基因的瞬时表达,取其肝脏提取总RNA,经RT-PCR方法扩增出一条534bp的目的条带,表明真核表达质粒构建成功。

牛双芽巴贝斯虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据PCR技术原理,建立起了牛双芽巴贝斯虫病PCR检测方法,并测定出该方法的敏感性为108.66 fg。特异性试验表明,除牛双芽巴贝斯虫出现特异扩增带(295 bp)外,其他的虫株均未出现特异性扩增带。采用PCR检测方法,通过对35份牛血样的检测,测得牛双芽巴贝斯虫病的阳性率为28.57%(10/35),说明PCR方法敏感性强、特异性高,不失为牛双芽巴贝斯虫病临床诊断的好方法。

牛双芽巴贝斯虫病PCR检测试剂盒研制

根据PCR技术原理建立牛双芽巴贝斯虫病PCR检测方法,自主研制出牛双芽巴贝斯虫病PCR检测试剂盒,结果为该方法的敏感性约41.2pg,特异性实验表明,除牛双芽巴贝斯虫的特异扩增带(318bp)外,其他的虫株如:附红体、环形泰勒焦虫、巴贝斯焦虫DNA模板均未出现特异性扩增带。采用PCR检测方法,对35份牛血样的检测,测得牛双芽巴贝斯虫病的阳性率为28.57%(10/35),说明PCR方法敏感性强、特异性高,此方法不失为牛双芽巴贝斯虫病临床诊断的好方法。

牛双芽巴贝斯虫rap-1蛋白的真核表达

以846 bp的牛双芽巴贝斯虫兰州株潜在药物靶标pGEM-T-rap-1质粒为模板,选择真核表达载体GFP,构建真核表达质粒。采用脂质体转染法,将质粒转染绵羊成纤维细胞,通过G418筛选,筛选阳性克隆。结果显示牛双芽巴贝斯虫rap-1蛋白在绵羊成纤维细胞内成功表达。

牛双芽巴贝斯虫rap-1基因的克隆与序列分析

对牛双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)潜在药物靶标Rap-1的基因进行克隆与序列分析。以兰州株牛双芽巴贝斯虫基因组为模板,经PCR扩增获得了rap-1基因,将该基因克隆到pGEM-T Easy Vector上,对重组质粒进行PCR扩增,对目的基因进行酶切鉴定及序列测定分析。结果表明,rap-1基因长度为846 bp,同源性分析结果显示,克隆序列与GenBank收录的巴西株牛双芽巴贝斯虫的核苷酸序列同源性为99.74%,说明兰州株牛双芽巴贝斯虫的rap-1与GenBank公布的参考基因具有高度同源性,rap-1基因具有很高的保守性。

奶牛梨形虫病的诊治

奶牛梨形虫病，也称焦虫病，主要由牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫和牛环形泰勒梨形虫引起的寄生虫疾病。牛双芽巴贝斯虫寄生在红细胞内，而牛环形泰勒梨形虫则寄生在红细胞和网状系统内。蜱是梨形虫的终末宿主，也是传播者。当蜱吸食含有梨形虫病牛的血液后，梨形虫在蜱体内进行有性繁殖，虫卵变成很多幼虫和若虫，子孢子存在于唾液腺。当蜱再次吸食健康牛血液时则将子孢子输入到牛体的红细胞内，进行无性出芽繁殖，而环形泰勒梨形虫的子孢子也可进入网状内皮系统，进行裂殖生殖，因此在淋巴细胞内有石榴体。

畜牧兽医科技文摘

中药四黄提取物对AA肉仔鸡法氏囊组织结构的影响/金光明(安徽科技学院动物科学学院,安徽凤阳233100),韩玉娟,丁常宏//安徽科学学院学报.-2012,(1).-5～8试验研究了四黄提取物对AA肉鸡法氏囊组织结构的影响。选用1日龄健康的AA肉仔鸡200只,随机分为实验组和对照组,每组100只,分四个重复组。