牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用

为了研究牛结核病新型诊断试剂,提高诊断的特异性和敏感性,我们用大肠杆菌工程菌表达了牛型分枝杆菌特异性抗原MPB70并提纯蛋白建立了牛结核病乳胶凝集试验(LAT)诊断方法。MPB70是一种牛型分枝杆菌特异性分泌而卡介苗BCG缺失的蛋白质,热稳定性好,用此蛋白建立的乳胶凝集方法具有良好的敏感性、特异性以及较长的保存期,检测70份临床奶牛血清,与皮内变态反应和间接血凝方法相比较分别具有71.4%和88.6%的符合率。该方法还可鉴别诊断自然感染和疫苗免疫接种。我们建立的牛型分枝杆菌MPB70蛋白乳胶凝集试验诊断方法将分子生物学手段和经典试验方法有机结合,为临床快速检测牛结核病血清特异性抗体水平提供了行之有效的方法,。

不同剂量牛型结核杆菌卡介苗对EAE模型的诱导

目的探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)非敏感品系Wistar大鼠加用不同剂量牛型结核杆菌卡介苗(mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin,M.bovis BCG)对EAE模型诱导的作用。方法将Wistar大鼠分为EAE1、EAE2、EAE3、EAE4共4组,然后分别用含4、8、10、12 mg M.bovis BCG/mL完全福(氏)佐剂(CFA)加豚鼠脑脊髓匀浆(GPSCH)制备不同浓度的完全抗原,分别免疫诱导Wistar大鼠EAE。观察不同剂量M.bovis BCG对诱导EAE模型发病情况、各项临床指标的影响,同时取脑和脊髓制成石蜡切片,行HE染色观察组织形态变化,行单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA原位杂交(ISH)计数其阳性细胞百分率。结果EAE3、EAE4组的发病率、体重减轻、临床症状评分、MCP-1 mRNA阳性细胞数显著高于EAE1、EAE2组(均P<0.05)。结论M.bovis BCG浓度的高低影响Wistar大鼠EAE的发病率。

几种消毒剂对牛型结核分枝杆菌的杀菌效果试验

为了研究复合酚、氢氧化钠、聚维酮碘等消毒剂在不同浓度、不同作用时间对牛型结核分枝杆菌的杀菌效果;本研究以浓度为20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%的消毒剂分别对牛型结核杆菌进行处理,作用时间分别为10、20、30、60 min、1、2、6、12 h;结果显示,浓度在0.2%及以上的复合酚在12 h内可杀灭牛型结核分枝杆菌,1%以上聚维酮碘处理6 h以上可杀灭牛型结核分枝杆菌,而所有试验浓度的氢氧化钠对牛型结核分枝杆菌没有杀灭作用;本研究结果表明,复合酚和聚维酮碘可用于环境的牛型结核分枝杆菌的净化。

应用实时PCR检测红鹿感染牛型结核杆菌后IFN-γ和IL-4mRNA的表达

目的 揭示红鹿抗结核杆菌感染的免疫反应途径。方法 共采用 2 0只红鹿 ,其中一组 10只对牛型结核杆菌(Mycobacteriumbovis,M bovis)有自然抵抗力 ,另一组 10只对M bovis敏感。两组各取 5只接种活的卡介苗 (BCG) ,余下 5只不接种。接种卡介苗 8周后所有的红鹿都注射有毒力的M bovis,在注射M bovis4周前以及 6周后分别收集外周血单核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBMC) ,PBMC在与美洲商陆原 (PokeweedMitogen ,PWM)共育后测定细胞因子Inter feron -γ(IFN -γ)和Interleukin - 4 (IL - 4 )mRNA的表达水平。mRNA的定量测定是在ABIPRISM 770 0序列检测系统上应用TaqManReal-time11PCR技术进行的。结果 在红鹿接受M bovis刺激前后PBMC中IFN -γ和IL - 4mRNA的表达水平有显著性差异。结论 红鹿抵抗结核杆菌感染的免疫反应是复杂的混合细胞反应型 ,Th1,Th2细胞反应均加强。

抗牛型结核杆菌单克隆抗体的制备、鉴定及其纯化抗原的研究

用牛结核杆菌超声抗原及纯蛋白衍生物(PPD)免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选和克隆化得到9株稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,应用抗原蛋白酶消化试验、抗原过碘酸氧化试验、加成试验及免疫印迹分析等,表明9株McAbs所识别抗原决定簇均对蛋白酶敏感,其中2株的抗原决定簇既存在于蛋白质中,又存在于脂类中。9株McAbs所识别的抗原分子量均为30kDa。4株均作用于同一抗原决定簇,其它McAb各作用于另外互不相同的抗原决定簇。免疫电镜观察,McAb 1A3所作用的蛋白质抗原主要分布在细胞内,少量分布于细菌胞壁。9株McAbs除1株外均显示出很强的特异性,其中4株仅与牛型结核茵反应阳性。利用McAb 1A3通过亲和层析柱纯化牛型结核杆菌PPD后,得到亲和层析纯抗原Ag 1A3,它仅与牛型结核杆菌免疫血清反应阳性,与其它分枝杆菌免疫血清反应阴性;对牛型结核杆菌致敏的豚鼠皮肤反应阳性,而与人型及BCG致敏豚鼠皮肤反应阴性。

TLR2和TLR4在牛型结核分枝杆菌诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用

目的:探讨Toll样受体(TLR)2和TLR4在牛型结核分枝杆菌卡介苗(BCG)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤中的作用。方法:用BCG刺激HK-2细胞,通过荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测TLR2、TLR4、转化生长因子β1(TGF-β1)和趋化因子CX3CL1的表达。将TLR2抗体和TLR4拮抗剂CLI-90分别与BCG共刺激HK-2细胞,通过荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测TGF-β1和CX3CL1的表达水平。结果:BCG刺激HK-2细胞可诱导TLR2、TLR4、TGF-β1和CX3CL1表达上调,TLR2抗体和TLR4拮抗剂可部分抑制BCG引起的TGF-β1和CX3CL1表达上调。结论:BCG可通过激活TLR2和TLR4引起TGF-β1和CX3CL1表达上调,提示TLR2和TLR4介导的信号通路在结核分枝杆菌致肾小管上皮细胞损伤中发挥重要作用。

抗牛型结核分支杆菌单克隆抗体的制备和鉴定

运用杂变瘤细胞技术，以牛型结核分支杆菌免疫Balb／c小鼠，用其超声波裂解液筛选杂交瘤细胞，得到了2株能稳定分泌抗牛型结核杆菌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5D4和4C2．并对它们的特性作了初步鉴定．经鉴定，2株单克隆抗体均为IgG，亚类．腹水经ELISA检测。效价可达1：1×10^4～1：1×10^5．同时分析了2株单抗的抗原位点，结果表明2株单抗针对不同的抗原位点．单抗的特异性试验结果显示，2株单抗与大肠杆菌，沙门氏菌。金黄色葡萄球菌等均没有反应．但都与人型结核分支杆菌有不同程度的交叉反应．并应用免疫胶体金技术制备牛结核杆菌胶体金快速诊断试纸条做应用性鉴定．该试纸条只与结核杆菌发生反应，而不与沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、李氏杆菌等发生交叉反应．该试纸条最低能检测出浓度为1×10^6个／mL的牛结核杆菌菌液。有较高的灵敏度．

猪源性牛型结核分枝杆菌分离与鉴定

目的2003年底和2004年初来自湖北、湖南、江西、广东等省的供港猪在屠宰时发现一定比例的猪有器官肉芽肿性病变。我们在湖北的J猪汤、M猪场接种牛型结核菌(10,000IU/头)和禽型结核菌素(2,500IU),均发现牛型结核菌素阳性猪。J猪场共接种1,692头猪,其阳性分布为:种猪阳性率为37%(7/19)、育肥猪阳性率为13%(118/941)、中小猪阳性率为3%(18/634)、保育舍仔猪阳率为1%(1/98):M猪场接种8头育肥猪有4头阳性。从J猪场选取94头育肥猪(61头PPD阳性、33头PPD阴性)跟踪到屠宰场观察器官病变,61头阳性猪全部有器官肉芽肿性病变,33头阴性猪2头有器官肉芽肿性病变。取典型病科研磨、2%NaOH处理30min,在改良酸性罗氏培养基上37℃培养28天长出淡黄色、表面干燥、似菜花样、呈颗粒状堆集的菌落。该分离菌在PNB、TCH鉴别培养基上不生长,对链霉素、利福平敏感,对青霉素不敏感,触酶、硝酸盐还原阴性,尿素酶阳性,接种大白兔可分离到抗酸菌。由以上可判定从猪中分离到牛型结核菌。

牛型结核分枝杆菌ESAT-6原核表达载体的制备和蛋白纯化

本研究拟构建牛型结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达载体,并纯化得到目的蛋白。将牛型结核分枝杆菌ESAT-6的PCR扩增产物连接到p NC-His E载体,构建ESAT6-p NC-His E重组质粒。将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定为阳性;将该阳性枯草芽孢杆菌单菌落接种于培养基中,不需诱导即可分泌表达,离心取上清,并对上清进行纯化、检测,得到目的蛋白。本研究提供一种可快速、简便地获得大量枯草芽孢杆菌分泌性表达ESAT-6蛋白的方法。

坦桑尼亚人颈淋巴结炎中分离出牛型分支杆菌:相关原因是什么?

背景:坦桑尼亚北部和南部适于畜牧的社区。 设计:观察性研究。 目的:确定这些地区乡村结核病诊所结核病病例中牛型分支杆菌感染的情况。 方法:以经临床证实的149例结核病病例作为样本。根据病变部位取适当的标本在含甘油或丙酮酸的两种罗氏培养基上进行培养。共培养分离出4株分支杆菌并进行生化分型。 结果:从所有各类型结核病病人中分离的分支杆菌菌株中,有31株(70.5％)被证明为结核分支杆菌,7株(15.9％)为牛型分支杆菌,6株(13.6％)为其他分支杆菌。肺外结核中牛型分支杆菌的分离率(28.6％)显著高于肺结核(4.3％)(P<0.05)。 结论:根据这些发现,应将牛型分支杆菌视为坦桑尼亚乡村居民可能的致病原。需进一步在该社区中牲畜和牲畜饲养人之间建立一个动物传染人的传染链。

用单克隆抗体对牛型结核杆菌早期培养物进行菌型鉴定的研究

用抗牛型结核杆菌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）１Ａ３和抗牛型结核杆菌免疫血清经酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对１９种分支杆菌参考株进行检测，证明了抗牛型结核杆菌ＭｃＡｂ１Ａ３的特异性和抗牛型结核杆菌免疫血清（ＩＭＳ）的相对非特异性。用ＭｃＡｂ１Ａ３对３６株分支杆菌临床分离株的早期培养物（培养３周）进行菌型鉴定，所需菌量最少仅２×１０７，即可鉴定出临床分离株中的牛型结核杆菌，敏感性和特异性均为１００％。此方法较常规微生物鉴定方法简单、省时，是一种有发展前途的菌型鉴定方法。

应用TaqMan荧光定量PCR检测牛分枝杆菌

为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究以GenBank登录的M.bovis特有229 bp基因为研究对象,设计并合成引物及探针。该方法具有较好的特异性,与标准质控菌株呈阳性反应,与其他微生物样品呈阴性反应;灵敏性最低检测值可达1 pg/mL;对20阳性临床样品进行荧光定量PCR检测,均为阳性;而对培养为阴性的20份临床样品进行检测,6份为阳性。该研究结果表明,建立的方法特异性强,敏感性高,稳定性好,能够用于M.bovis的鉴别检测,对牛分枝杆菌病的快速检测和早期诊断具有重要意义。

牛型布氏菌单克隆抗独特型抗体苗生产工艺的研究

采用生物反应器悬浮培养生产牛布氏杆菌单克隆抗独特型杂交瘤细胞，定期收获细胞，技106细胞／鼠行腹腔接种已用石蜡油预处理的BALB／c小鼠，从而大量生产腹水阻断效价达1：40000的牛布氏杆菌单克隆抗独特型抗体。佐以20％的铝胶生理盐水，配成新一代牛布氏杆菌二抗苗，经大动物（牛）攻毒试验，保护力可达6个月以上，其它各项检定指标均达到规程要求，并建立了切实可行的生产工艺。

抗结核分枝杆菌单克隆抗体用于结核杆菌抗原分析、鉴定及检测的研究

目前,结核病仍是严重危胁人类健康的传染病,如何有效控制结核病,并且降低结核病患病率和发病率是我国乃至世界卫生工作中一项迫在眉睫的任务。因此,对于结核病的诊断和治疗的研究仍有许多工作要做。抗结核分枝杆菌单克隆抗体的研制对于结核病的血清学诊断、结核病的治疗以及结核分枝杆菌抗原的分析都有重要的意义。

非结核分枝杆菌感染致慢性脓胸一例

非结核分枝杆菌病是由人型、牛型结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）所引起的肺部和肺外疾病，多见于肺部病变，也可见于淋巴结、皮肤软组织和骨骼系统的感染，对严重细胞免疫抑制患者甚至还可引起血行性播散，但极少见胸膜腔感染进而形成慢性脓胸的报道，且近年来随着HIV感染和AIDS的流行，非结核分枝杆菌病也日渐增多。

182例分枝杆菌菌型鉴定和耐药性试验的研究

目的了解石家庄市门诊及住院肺结核病人的耐药情况,为临床治疗肺结核病人提供可靠的实验数据。方法对2002～2005年就诊于我所的肺结核病人的痰标本,用改良罗氏法培养,对分离培养的阳性菌株进行菌型鉴定及五种抗结核药物(INH、SM、RFP、EMB、PAS)的耐药性测试。结果①182例痰培养阳性标本,人型结核分枝杆菌146例,牛型分枝杆菌24例,非典型分枝杆菌12例。②182例耐药菌中,耐单药80例,耐二药43例,耐三药39例,耐四药16例,耐五药14例,其耐药率分别为43.95%、23.62%、21.43%、8.8%、2.2%。结论临床应根据结核杆菌药敏试验的结果,合理使用抗结核药物,减少耐药菌株的发生。

徐州市区电话机抗酸杆菌污染情况调查

电话机在使用过程中抗酸杆菌污染情况,根据部颁《消毒技术规范》中对物体表面采样方法,抽样调查了市区四种场所(机关办公室、邮电局、旅馆、市内公用电话)76部电话机。现将结果报告如下:

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。

牛源性人结核疫源追踪辨析

结核病是一种人畜共患传染病,牛和人是最常见的感染者。牛型分枝杆菌引起的人类结核病,其传染源可以来源于患者,也可以来源于患牛。通过辨析结核病菌感染及诊断防治中的各种复杂因素,对同型不同物种来源的分枝杆菌进行鉴别,以追踪结核病的传染源,从源头上防治结核病。