牛妊娠相关糖蛋白20真核表达及其结构与功能预测

旨在真核表达牛妊娠相关糖蛋白20(bovine pregnancy associated glycoproteins 20,BoPAG20),并对蛋白质结构与功能进行预测。参考GenBank中BoPAG20基因密码子进行优化并合成,构建真核表达载体pcMV3-BoPAG20,转染至293F细胞中进行瞬时表达。SDS-PAGE和Western blot检测表达效果,Ni^(2+)亲和磁珠纯化蛋白,用纯化后的蛋白免疫小鼠验证免疫原性,并对BoPAG20结构与功能进行预测分析。结果:优化后的BoPAG20基因长度为1143 bp,编码380个氨基酸残基,密码子适用指数(CAI)由原来的0.77提高到0.96,GC含量由48.91%提高到55.29%;成功构建了pcMV3-BoPAG20真核表达载体,转染至293F细胞中成功表达,获得BoPAG20蛋白相对分子量约为58 kDa;纯化后BoPAG20蛋白免疫小鼠,34 d后测定血清效价达到1∶10^(5);BoPAG20蛋白无跨膜螺旋区,为分泌性蛋白,信号肽是N端15个氨基酸,存在6个糖基化位点(Ser^(36)、Ser^(56)、Ser^(57)、Ser^(76)、Ser^(80)、Thr^(115))和8个B细胞抗原表位,二级结构由α-螺旋(18.68%)、无规则卷曲(45%)和延伸链(30.79%),无β-转角;与BoPAG20互作蛋白包括β-淀粉样蛋白(APP)和β-淀粉样前体样蛋白2(APLP2)。本研究成功表达并纯化出BoPAG20蛋白,证实其具有良好的免疫原性,并进行了结构和功能预测,为该蛋白的结构和功能研究奠定基础。

牛3种妊娠相关糖蛋白可视早孕试剂盒检测效果比较

旨在确定牛妊娠相关糖蛋白(PAGs)可视早孕试剂盒与超声检查的差异、检测准确性的判断标准,并比较牛3种PAGs可视早孕试剂盒的检测效果。采用酶联免疫吸附试验法检测牛的“未孕(特异性)”和“怀孕(灵敏性)”,并将检测结果与超声检查相比较,以此判断牛PAGs的检测准确性及检测效果。结果显示,3种PAGs试剂盒的检测结果与超声检查不存在显著性差别,可以用作商业化检测。该类试剂盒的灵敏性与超声检查的一致性高于93%,但不能达到100%,原因在于PAGs存在一定的半衰期,灵敏性只能作为牛PAGs检测准确性的参考依据,不能作为最终判断依据。而3种试剂盒的检测特异性与超声检查的一致性均可达100%,该类试剂盒可以作为准确性最终判断依据。3种试剂盒中,试剂盒2、3可以在人工输精后第27天达到100%,比试剂盒1提前4 d。

牛妊娠相关糖蛋白boPAG2双抗体夹心ELISA体系的建立

【目的】通过双抗体夹心ELISA体系实现对牛妊娠相关糖蛋白boPAG2的免疫学检测,为后续研发牛妊娠检测试剂盒奠定基础。【方法】将自制boPAG2作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,以细胞融合技术对呈阳性的杂交瘤细胞进行筛选。运用ELISA相加性试验筛选最佳配对抗体,初步建立起双抗体夹心酶联免疫吸附试验系统,采集牛场中120头荷斯坦奶牛血清样本进行初筛。【结果】筛选出3株能稳定分泌boPAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2C01,5E02,3B05。纯化出单克隆抗体滴度为(1∶22.48×10^4)^(1∶11.96×10^4),免疫球蛋白亚型均为IgG。ELISA相加性试验筛选出2株可识别boPAG2抗原不同表位的最佳配对抗体5E02和3B05。当5E02作为包被抗体,3B05作为检测抗体时,其最佳稀释质量浓度为1.25μg/mL,检测boPAG2的灵敏度可达5μg/mL。【结论】制备和选定了两株最佳配对单克隆抗体5E02和3B05,该对抗体效价高,通过建立双抗体夹心ELISA体系实现对boPAG2的免疫学检测,并对少量血清样品进行了初步鉴定。

牛妊娠相关糖蛋白18重组载体构建、表达条件优化和生物信息学分析

为了制备牛妊娠相关糖蛋白18(boPAG18),并预测其理化性质和功能,本试验优化密码子并合成boPAG 18基因,构建pET30a-boPAG18重组质粒。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的蛋白质表达量为指标,优化装液量、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度条件,采用亲和层析法纯化boPAG18,SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定。预测boPAG18的疏水性、信号肽、修饰位点、结构和蛋白相互作用。结果显示,经双酶切鉴定,pET30a-boPAG18重组质粒构建成功,boPAG 18基因1143 bp,表达蛋白约38 kDa。确定最佳表达条件为在OD 600 nm值为0.6,装液量为40 mL,IPTG终浓度为0.2 g/L,37℃诱导4 h。纯化的boPAG18纯度高达98%,浓度为2.63 mg/mL。该蛋白分子式为C_(1923)H_(3007)N_(519)O_(541)S_(17),分子质量为42.6 ku,等电点为9.31,亲水性平均值为-0.041,为两性蛋白,蛋白质不稳定指数为42.41,在水中不稳定;脂肪系数为88.43,有381个氨基酸;消光系数为47370 mol-1·cm-1,半衰期为30 h。boPAG18前15个氨基酸为信号肽,无跨膜区域;有糖基化修饰位点57个,磷酸化修饰位点68个,B细胞抗原表位13个,二级结构中α-螺旋占比19.42%、β-转角占比5.77%、无规则卷曲占比44.88%、延伸链占比29.92%;有7个相互作用蛋白,可能参与了母体在妊娠期的泌乳、抗菌和神经保护等调节功能。本试验为深入研究boPAG18的结构和功能提供了数据支持。

牛妊娠相关糖蛋白ELISA对早期妊娠诊断效果的影响

选取273头荷斯坦奶牛,在人工输精后的28d和75d分别采用牛妊娠相关糖蛋白(PAG)ELISA和直肠检查的方法进行妊娠诊断,比较PAG ELISA和直肠检查法的结果,旨在评价PAG ELISA对配种28d的奶牛进行早期妊娠诊断的准确性。结果表明,PAG ELISA法妊娠诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%,与75d直肠检查结果相同,可用于母牛的早期妊娠诊断。妊娠诊断对于母牛保胎、分群管理及提高繁殖效率等具有非常重要的意义。

牛妊娠相关糖蛋白1(bPAG1)的真核表达及纯化

[目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载体后转染到CHO细胞,经SDS-PAGE和Western Blot检测重组牛妊娠相关糖蛋白1(rbPAG1)的表达效果。[结果]PCR扩增得到1218 bp的bPAG1基因片段,构建的重组质粒PCDNA3.1(-)-bPAG1经双酶切获得约5400和1218 bp的2条片段,与预期相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为62 kDa的bPAG1重组蛋白,通过Ni柱亲和层析纯化后,rbPAG1纯度可达88%。[结论]本研究为bPAG抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研发奠定了基础。

牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的真核表达及纯化

【目的】构建proEM-bPAG9重组表达载体,并在HEK293细胞中转染表达。为进一步抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研究奠定基础。【方法】通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体proEM中,构建proEM-bPAG9重组载体后转到DH5α感受态细胞中,重组质粒转染至哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达,再通过亲和层析纯化bPAG9重组蛋白(rbPAG9),经SDS-PAGE和Western Blot检测rbPAG的表达效果。【结果】通过全基因合成法得到1 182 bp的bPAG9基因片段,构建的重组质粒proEM-bPAG9经双酶切获得约4 369 bp和1 176 bp的两条片段,与预期值相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为68 kDa的bPAG9重组蛋白,通过Ni2+亲和层析纯化后,rbPAG9纯度可达90%。【结论】通过基因优化及真核表达获得分子质量为68 kDa的rbPAG9重组蛋白。

牛妊娠相关糖蛋白检测技术研究进展

妊娠诊断是牛繁殖过程中的重要环节。为了提高牛群繁殖效率,牛养殖场从业人员不断引入更高效的发情揭发、同期发情、妊娠诊断等技术。妊娠相关糖蛋白(PAGs)法作为近年来在规模化牛养殖场开始应用的妊娠诊断技术,被证明具有较高的诊断效率和准确率。本文针对牛妊娠相关糖蛋白检测技术研究现状,对该技术研究进展进行综述。

基于密码子优化策略的牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的原核表达及纯化

为了构建pET30a-bPAG9重组表达载体,并在BL21(DE3)感受态细胞中转染高效表达牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9),通过生物信息学技术对bPAG9基因进行密码子优化,人工合成bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体pET30a中。将构建的重组质粒pET30a-bPAG9转染至BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,经过超声波裂解和亲和层析方法获得重组蛋白bPAG9。用SDS-PAGE和Western Blot方法检测重组蛋白bPAG9的表达效果。结果显示,PCR扩增得到1128 bp的优化bPAG9基因片段,构建的重组质粒pET30a-bPAG9经双酶切获得约5244 bp和1125 bp的2条片段,与预期值相符;对重组载体测序,测序结果与优化后的基因碱基序列完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,获得相对分子质量约为4.0×10^4的bPAG9重组蛋白,通过亲和层析纯化后,重组蛋白bPAG9纯度到达90%以上。

牛妊娠相关糖蛋白基因boPAG4的原核表达及单克隆抗体的制备

为了获得具有高特异性和高免疫原性的boPAG4单克隆抗体,本试验以PCR技术扩增荷斯坦奶牛boPAG4基因,构建重组质粒pCold TF-boPAG4后,在E.coli BL21(DE3)中表达pCold TF-boPAG4蛋白并优化。以重组蛋白pCold TF-boPAG4作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合最终筛选出3株能稳定分泌pCold TF-boPAG4单克隆抗体的杂交瘤细胞,pCold TF-boPAG4单克隆抗体滴度均为1×105以上。纯化蛋白pCold TF-boPAG4经HRV3C蛋白酶酶切后制备出boPAG4抗原,Westernblot(WB)结果显示,3种单克隆抗体都能特异性识别boPAG4抗原,pCold TF-boPAG4单克隆抗体的成功制备为开发现场奶牛妊娠ELISA检测系统提供了理论支持。

牛妊娠相关糖蛋白6基因密码子优化及其在HEK293细胞中的表达

[目的]解决天然牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)不易分离纯化的问题,获得高效异源表达且具有良好免疫反应性的bPAG6,为国产bPAG检测产品的研发提供技术支持。[方法]根据宿主细胞对密码子的偏好性,利用MaxCodon^TM在不改变氨基酸序列的前提下,对bPAG6基因密码子进行优化,采用全基因合成技术扩增优化后的bPAG6基因,构建proEM-bPA G6重组载体,并转染至HEK293细胞中进行高效表达;然后通过SDS-PAGE电泳、Western blotting和ELISA检测重组蛋白的表达效果及免疫反应性,并利用在线生物信息学分析软件对重组蛋白的结构及功能进行预测。[结果]优化后bPAG6基因的密码子适用指数(CAI)由0.80提高到0.96,G+C含量由49.4%提高到58.8%,其蛋白编码区(CDS)长度为1137 bp,共编码379个氨基酸残基。将全基因合成技术扩增获得的bPAG6基因插入proEM载体构建proEM-bPA G6重组载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定可获得2条与预期结果相符的片段[proEM载体(4369 bp)和bPAG6基因(1176 bp)],测序结果也显示其碱基序列与优化后的bPAG6基因完全一致。proEM-bPA G6重组载体转染HEK293细胞表达获得的重组蛋白bPAG6分子量约46 kD。重组蛋白bPAG6可被抗bPAG6抗体识别,即具有良好的免疫反应性。重组蛋白bPAG6信号肽由N端的前15个氨基酸残基组成;存在5个N-糖基化位点,其N-糖基化修饰主要位于57Asn、73Asn、102Asn、124Asn和181Asn位点处;重组蛋白bPAG6为分泌性蛋白,无跨膜螺旋区,其二级结构由无规则卷曲(42.74%)、延伸链(31.93%)、α-螺旋(19.26%)和β-转角(6.07%)组成。[结论]通过基因优化及真核表达获得的重组蛋白bPAG6具有良好免疫反应性,可作为抗原应用于牛早期妊娠快速诊断产品的研发。

肉牛妊娠初期血、尿中孕酮、妊娠相关糖蛋白、早孕因子的变化

[目的]探讨肉牛妊娠初期血液和尿液中孕酮(P_4)、妊娠相关糖蛋白(PAG)、早孕因子(EPF)的变化,为肉牛早期妊娠诊断奠定基础。[方法]采集肉牛配种后第0、1、8、17、21、28、35天的血、尿液,通过ELISA检测血、尿中P_4、PAG、EPF 3种激素的浓度。[结果]在配后0～35 d,妊娠与非妊娠母牛血、尿中P_4和PAG浓度变化平缓,而EPF差异较明显,3种激素血液中浓度均高于尿液中。其中,妊娠牛血液中EPF浓度在配后第8天显著(P<0.05)高于非妊娠牛。[结论]血、尿中EPF浓度变化能反映肉牛的妊娠状态。

基于电融合方法的牛妊娠相关糖蛋白单克隆抗体制备及其应用

为了制备抗牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)单克隆抗体,本试验提纯妊娠母牛子叶bPAG,免疫小鼠后进行细胞电融合,通过ELISA、Western blot方法对抗bPAG单克隆抗体进行筛选。结果显示:获得5株bPAG特异性强、灵敏度高的单克隆抗体,抗体最高效价为1∶256000,亲和力最高可达到3.75×10^(7) L/mol,5株单克隆抗体均能识别天然bPAG蛋白。采用高碘酸钠法对单抗标记辣根过氧化物酶(HRP),将最佳配对抗体用于建立双抗夹心ELISA方法,对64个血清样本进行检测。结果显示:以10H2作为捕获抗体与HRP-5G1配对建立的双抗夹心ELISA方法检测bPAG阳性和阴性血清样本,与爱德士牛早孕检测试剂盒比较符合率达95.2%。结果表明,本试验运用细胞电融合法制备的抗bPAG单克隆抗体可应用于建立双抗夹心ELISA体系,为下一步bPAG检测试剂盒的研制提供技术支持。

牛妊娠相关糖蛋白10的制备及其生物信息学分析

目的重组表达牛妊娠相关糖蛋白10(bovin pregnancy associated glycoproteins 10,BoPAG10),并对其结构和功能进行预测分析。方法通过密码子优化并合成BoPAG10基因,构建pcDNA3.1-BoPAG10重组表达载体,并瞬转至293F细胞中,采用Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离纯化,通过SDS-PAGE和Western blot检测表达效果,利用生物信息学软件对BoPAG10基因编码蛋白进行结构和功能预测。结果PCR和双酶切鉴定BoPAG10基因为1173 bp,成功表达BoPAG10重组蛋白,大小为48 kDa的,含量质量分数为91%。BoPAG10蛋白N端29个氨基酸为信号肽,7个糖基化位点和11个B细胞抗原表位。结论本研究作者成功表达并纯化出BoPAG10蛋白,为BoPAG10蛋白的结构和功能的研究以及抗BoPAG10单克隆抗体的制备奠定基础。

奶牛妊娠相关糖蛋白BoPAG16的表达及其结构功能预测

[目的]为了获得奶牛妊娠相关糖蛋白16(bovin pregnancy associated glycoproteins 16,BoPAG16),并对该蛋白进行结构和功能分析。[方法]从荷斯坦奶牛胎盘子叶中扩增BoPAG16基因,并用构建真核表达载体pcDNA3.1-Flag-BoPAG16,转染至293F细胞中,用SDS-PAGE和Western Blotting检测表达效果,用Flag-tag亲和层析柱纯化蛋白,并对BoPAG16基因编码的蛋白进行结构和功能预测分析。[结果]BoPAG16基因在293F细胞中成功表达,大小为56 kDa,纯化后纯度达到92%。预测BoPAG16蛋白N端15个氨基酸为信号肽,6个糖基化位点和13个B细胞抗原表位。[结论]成功表达并纯化奶牛妊娠相关糖蛋白BoPAG16,BoPAG16蛋白有6个糖基化位点和13个B细胞抗原表位。

奶牛场常用早期妊娠诊断技术研究进展

准确的妊娠诊断是奶牛场提升繁殖管理水平的重要手段之一。本文从诊断时间、操作繁琐程度、成本、准确度等方面,比较分析了直肠触诊法、超声波检查法、孕酮检测法、牛妊娠相关糖蛋白检测等奶牛早期妊娠诊断方法的优劣势,同时对各种诊断技术的发展进行了展望,为牧场繁殖管理实践提供指导。

梅花鹿胎盘中妊娠相关糖蛋白(PAG)纯化与鉴定

梅花鹿胎盘妊娠相关糖蛋白对维持妊娠有重要作用。本研究首次利用硫酸铵沉降、透析和冻干法,从梅花鹿胎盘中分离出妊娠相关糖蛋白(PAG),20%~50%和50%~80%硫酸铵梯度沉降蛋白,分子量分别在44.3 ku^66.4 ku处,并通过Western blot分析证实其有反应原性。