发酵乳杆菌对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤干预作用的研究

旨在研究发酵乳杆菌能否通过抑制NF-kB信号通路的激活,调控下游炎性细胞因子,进而对脂磷壁酸(LTA)所诱导的牛子宫内膜细胞(BEND)炎性损伤发挥保护作用,并通过体外试验对其作用机制进一步研究,为解决牛子宫内膜炎的治疗难题提供方向。以牛子宫内膜细胞为研究对象,LTA和发酵乳杆菌分别作为毒药与解药来建立体外细胞试验模型,测定细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的分泌量和炎性相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65 mRNA的表达量。结果表明:LTA组、LTA+Lf组、Lf组炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达水平均高于对照组。LTA组与对照组比较差异极显著(p<0.01);Lf组与对照组比较,TNF-α、IL-6细胞因子差异不显著(p>0.05),IL-1β、IL-8细胞因子差异显著(p<0.05);LTA+Lf组与LTA组比较,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达量显著降低(p<0.05)。LTA组、LTA+Lf组、Lf组的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量均高于对照组。LTA组与对照组相比,7种基因m RNA的表达量极显著增加(p<0.01);Lf组与对照组相比,TNF-α、IL-6基因mRNA的表达量增加不显著(p>0.05),IL-8基因mRNA的表达量增加显著(p<0.05),IL-1β、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量极显著增加(p<0.01);LTA+Lf组与LTA组相比,7种基因mRNA的表达量均极显著降低(p<0.01)。发酵乳杆菌能够抑制NF-kB信号传导通路,调控炎性细胞因子的表达与释放,抑制炎性反应的发生,缓解LTA的细胞毒性,对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤起干预作用。

LIF调控奶牛子宫内膜上皮细胞容受性基因表达研究

接受态的子宫内膜对于奶牛胚胎的成功植入至关重要。为探讨白血病抑制因子(LIF)对奶牛子宫内膜容受性的调控机制,试验将奶牛子宫内膜上皮细胞分为对照组、LIF处理组、LIF+STAT3共处理组,研究了LIF对子宫内膜容受性的作用和STAT3信号通路对奶牛子宫内膜容受性的调控。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测容受性相关基因HOXa10、VEGF和炎症相关基因TLR4、NF-κB的mRNA和蛋白表达变化。结果表明:与对照组相比,LIF处理组奶牛子宫内膜上皮细胞的容受性相关基因HOXa10、VEGF的表达量显著增加(P<0.05),炎症相关基因TLR4、NF-κB的表达量显著增加(P<0.05)。LIF+STAT3共处理组的HOXa10、VEGF的表达量与LIF处理组比较显著降低(P<0.05),与对照组无显著差异(P>0.05);TLR4、NF-κB的表达量与LIF处理组比较无显著差异(P>0.05),显著高于对照组(P<0.05)。说明LIF通过激活STAT3信号通路调控子宫内膜上皮细胞HOXa10、VEGF的表达,能够增强子宫内膜的容受性。

LPS对牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8启动子区甲基化状态的影响

为了解细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导牛子宫内膜细胞白介素6(Interleukin 6,IL-6)和白介素8(Interleukin 8,IL-8)mRNA表达上调的分子机制,利用亚硫酸氢测序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)技术分析LPS对牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8基因启动子区甲基化状态的影响,明确DNA甲基化对LPS诱导的牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8基因表达的调控作用。用1μg/m L的LPS处理牛子宫内膜细胞24 h,用BSP技术检测IL-6和IL-8表达量及其启动子区甲基化水平。结果表明:LPS可显著提高IL-6和IL-8表达量,伴随着IL-6和IL-8启动子区DNA甲基化水平降低,尤其在IL-6启动子区-660及IL-8启动子区-120和-48位点降低最明显。结果提示,LPS可降低牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8启动子特定位点甲基化水平。

Microcystin-LR对体外牛子宫内膜上皮细胞增殖和凋亡的影响

使用Microcystin-LR体外处理牛子宫内膜上皮细胞,探究其对细胞活率影响及分子调控机制,以期为提高牛繁殖效率提供理论基础和实践依据。试验运用CCK-8检测MC-LR处理后细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率;Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡;实时荧光定量检测Pi3k、Akt、mTOR、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9和p53基因mRNA表达量。Western blot检测Pi3k、Akt、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量。结果表明,不同浓度和时间处理下细胞存活率出现升高和降低两种相反情况,根据CCK-8检测结果,选择12 h,100μg·L^(-1)和24 h,160μg·L^(-1)两种处理方案开展后续试验。在12 h,100μg·L^(-1)条件下,Pi3k、Akt、mTOR的mRNA表达量升高(P<0.01),Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9基因mRNA表达量下降(P<0.05),Pi3k和Akt蛋白表达量升高(P<0.05),Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量降低(P<0.05)。处于G0/G1期细胞数量减少(P<0.01),处于G2/M和S期细胞数量增加(P<0.01);p53基因mRNA表达量升高(P<0.05)。在24 h,160μg·L^(-1)处理条件下,Caspase-3、Caspase-9、Bax/Bcl2基因mRNA表达量升高(P<0.05),Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量升高(P<0.05)。研究表明,100μg·L^(-1)MC-LR处理细胞12 h,细胞通过增强Pi3k-Akt-mTOR信号通路,抑制线粒体凋亡通路促进细胞增殖,同时导致处于G1期细胞数量减少、G2/M期和S期细胞数量增加。160μg·L^(-1)MC-LR处理细胞24 h,细胞通过活化线粒体凋亡通路发生凋亡。

精氨酸对干扰素-tau处理牛子宫内膜上皮细胞基因表达的影响

试验旨在研究精氨酸(Arg)对干扰素-tau(interferon-tau,IFNT)处理的牛子宫内膜上皮细胞的调控作用及其可能的机制。将牛子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养板中,当达到70%~80%融合度时,向细胞培养基中加入不同浓度的IFNT(0、100 ng/mL),12 h后收集细胞检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路相关基因的表达情况;用不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L)Arg处理牛子宫内膜上皮细胞,24 h后用CCK8法检测其对增殖率的影响,筛选出Arg的最佳作用浓度;将子宫内膜上皮细胞随机分为Arg饥饿组、Arg饥饿+IFNT处理组、Arg添加+IFNT处理组,在Arg饥饿或添加处理6 h后加入100 ng/mL IFNT,IFNT处理12 h后检测UPR通路(BiP、PERK、CHOP、ATF6)、凋亡(BAX、Caspase9)和容受性(HOXA10)相关基因表达情况。结果显示,IFNT刺激可诱导牛子宫内膜上皮细胞UPR通路相关基因BiP、PERK、CHOP、ATF6的表达显著上调;0.5 mmol/L Arg可显著提高牛子宫内膜上皮细胞的增殖率(P<0.05);Arg缺失可显著上调IFNT诱导下牛子宫内膜上皮细胞中BiP、PERK、CHOP、ATF6和BAX基因mRNA的表达(P<0.05),并显著下调HOXA10基因mRNA的表达(P<0.05),但对Caspase9基因mRNA表达无显著影响(P>0.05)。结果表明,Arg缺失可导致牛子宫内膜上皮细胞发生内质网应激,并影响子宫内膜宫受性的建立,可为进一步揭示Arg对牛子宫内膜的调控机制及制定减少妊娠早期胚胎丢失的营养调控策略提供参考。