牛嵴病毒研究进展

牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKV)是小核糖核酸病毒科、嵴病毒属成员的一种无囊膜、单股、正链RNA病毒。该病毒常与其他常见致牛腹泻病毒(牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒等混合感染),是可能导致牛腹泻的病原之一。已经在包括中国在内的世界多个国家和地区检测到该病毒。该文对牛嵴病毒的病原学、流行情况、检测方法等方面的研究进行综述,以期为该病毒今后的研究和防控提供参考。

牛嵴病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。【结果】该方法最佳上下游引物浓度均为300nmol·L^(-1),探针浓度为400 nmol·L^(-1),在1×10^(1)~1×10^(8)copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.999,扩增效率为103%;特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出牛嵴病毒;敏感性较高,对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)copies·μL^(-1),而普通RT-PCR对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(2)copies·μL^(-1);重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。2021年3~5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BKoV的检出率为24.3%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为3.7×10^(5)copies·μL^(-1),健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×10^(3)copies·μL^(-1)。【结论】建立的牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BKoV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

牛诺如病毒及牛嵴病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据BNoV和BKoV基因组的保守区域设计2对特异性引物,建立了能同时检测牛诺如病毒(Bovine norovirus,BNo V)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKo V)的双重PCR检测方法。该方法能特异性扩增BNo V和BKo V的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病毒性病原;BNoV和BKoV的最低检测限分别为5.39×105 copies/μL和2.23×106 copies/μL;对临床采集的127份犊牛腹泻样品检测结果显示,BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKoV的阳性率为4.72%(6/127),两者与单一PCR检测结果相一致,符合率为100%。本研究建立的双重PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,可用于BNoV和BKoV的快速检测和流行病学调查。

牛嵴病毒VP3蛋白的原核表达及初步应用

牛嵴病毒(BKV)是近几年在牛消化道中新发现的病毒,其致病性尚不清楚。我们的相关研究已表明,该病毒在我国的牛群中普遍存在。为重组表达BKV VP3蛋白,本研究采用RT-PCR方法从牛腹泻粪便样品中扩增BKV VP3蛋白的编码基因,将其克隆至pET-28a(+)载体中构建原核重组表达质粒pET-VP3。将pET-VP3转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达及SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量约为27.8 ku,以包涵体形式存在。采用电洗脱方法纯化该重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,制备抗BKV VP3的多克隆抗体。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了间接ELISA抗体检测方法。小范围调查结果显示,在检测的牛群中BKV感染率较高。

牛诺如病毒和牛嵴病毒及牛环曲病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为了解牛诺如病毒(BNo V)、牛嵴病毒(BKV)和牛环曲病毒(BTo V)在国内的流行情况,本研究参考Gen Bank中登录的BNo V Rd Rp基因、BKV 3D基因和BTo V N基因保守区域,设计3对特异性引物,成功建立了能够同时快速检测BNo V、BKV、BTo V的三重RT-PCR方法。该方法特异性较强,仅对BNo V、BKV、BTo V扩增出特异性条带,对其他5种常见引发犊牛腹泻的病毒均未扩增出条带;敏感性较高,针对p MD18-T-BNo V、p MD18-T-BKV和p MD18-T-BTo V质粒标准品的最低检测限分别为2.73×10^(4)copies/μL、2.87×10^(4)copies/μL、3.18×10^(3)copies/μL;重复性好,同批次样品的3次检测结果均一致。使用该方法对153份临床样品进行检测,结果显示,BNo V、BKV、BToV的阳性率分别为11.11%、25.49%、38.56%,3种病毒混合感染率为7.18%。与其他学者建立的单一RT-PCR检测方法相比,符合率分别为94.77%、93.46%、91.50%。上述结果表明,本试验建立的三重RT-PCR方法为犊牛上述国内新发病毒快速检测及流行病学调查提供了技术支撑。

染料法实时荧光PCR检测牛嵴病毒

牛嵴病毒(BKoV)可能是与犊牛腹泻相关的潜在病原,为建立快速检测BKoV的方法,本研究根据BKoV 3D基因的保守序列,设计特异性引物对,通过优化反应条件和体系,建立了基于EvaGreen染料检测BKoV的实时定量PCR方法。该方法Ct值与模板在1.08×10^(2)~1.08×10^(8) copies/μL范围内线性关系良好,扩增效率为106.4%;该方法仅检测BKoV时结果呈阳性,检测其他犊牛腹泻相关病原时结果呈阴性;能检出BKoV的最低检出限为10.8 copies/μL;批内和批间的变异系数均小于2%,重复性好。用该方法对311份采自河南、山东和四川省的犊牛腹泻样本进行检测,河南省BKoV的检出率为7.38%(20/271),其他两省的样本均未检测出BKoV。本研究建立的方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BKoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。

荧光探针PCR检测牛嵴病毒的方法建立

牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)是与犊牛腹泻密切相关的病原,试验针对BKoV 3D基因设计特异性引物和探针,建立快速检测BKoV的实验室方法。该方法仅能特异性扩增BKoV,对其他犊牛腹泻病原无扩增,特异性较强;对BKoV质粒标准品的最低检出限为11.0拷贝/μL,灵敏性较强;且组内与组间变异系数均小于2%,重复性较好。对采集自河南省的221份犊牛腹泻临床样本进行检测,BKoV的核酸检出率为9.05%(20/221)。本研究建立的检测方法为BKoV的临床快速检测和流行病学调查提供了有效手段。

牛冠状病毒、牛诺如病毒和牛嵴病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能同时检测牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKV)的方法,根据BCoV、BNoV和BKV基因组的保守区域设计3对特异性引物,预期特异性扩增BCoV、BNoV和BKV的片段大小分别为896,542,216 bp,建立了BCoV、BNoV和BKV的多重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增BCoV、BNoV和BKV的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻(calf diarrhea,CD)病原;BCoV、BNoV和BKV的最低检测限分别为9.51×10^5,5.39×10^5,2.23×10^6 copies/μL。对采集自河南部分地区的127份CD样品的检测结果显示,BCoV的阳性率为14.96%(19/127),BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKV的阳性率为4.72%(6/127),三者与单一PCR检测结果相一致。结果表明,本研究建立的多重PCR方法可用于BCoV、BNoV和BKV的检测和流行病学调查。

哺乳期腹泻犊牛粪便中病原流行状况调查

随着国内牧场饲养管理水平的不断提高,犊牛腹泻问题越来越受到重视。为获取国内牧场哺乳期腹泻犊牛粪便中常见病原及牛诺如病毒和牛嵴病毒的流行情况,本次调查采用多种病原检测方法对国内6个地区18个牧场的130份哺乳期腹泻犊牛粪便样品中的7种病原进行检测。调查发现:牛轮状病毒和微小隐孢子虫检出率最高,分别为38.5%(50/130)和37.7%(49/130);牛冠状病毒、大肠杆菌F5和球虫检出率分别为13.1%(17/130)、6.2%(8/130)和3.8%(5/130);牛诺如病毒和牛嵴病毒的检出率分别为10.0%(13/130)和4.6%(6/130)。并在2日龄腹泻犊牛粪便中检出了微小隐孢子虫。调查表明,轮状病毒和隐孢子虫在犊牛中感染率最高,牛诺如病毒和牛嵴病毒等新发病原的流行情况仍需要进一步调查。

动物嵴病毒病原特点及检测

本文综述了动物嵴病毒的发现、流行病学、分子生物学特点以及病原检测的研究进展,探索分析了嵴病毒仍需进一步研究和解决的问题。