牛巴贝斯虫和肺炎克雷伯氏菌混合感染的诊断

为对广西某肉牛场病死牛的病原进行追踪,采用血液涂片检查、寄生虫PCR鉴定和细菌分离培养等方法进行确诊,并对分离菌采用16SrRNA基因鉴定、致病性试验和药敏试验等分析其病原。结果表明,血液涂片检查未发现牛巴贝斯虫虫体;使用牛巴贝斯虫特异性引物PCR扩增出约684 bp目的片段;从病死牛肺脏分离到一株革兰氏阴性菌,16SrRNA基因鉴定表明与NCBI中的肺炎克雷伯氏菌参考株(MN691773)同源性为99.6%;分离菌可使试验小鼠致死;分离菌对头孢曲松、头孢噻肟、环丙沙星、氧氟沙星等4种药物高度敏感,对利福平、红霉素、阿奇霉素、复方新诺明、氨苄西林、林可霉素、青霉素、四环素、多西环素、多粘菌素等10种药物耐药。本结果可为牛场防治类似疾病提供参考。

牛巴贝斯虫病及其防治措施

牛巴贝斯虫病是牛被双芽巴贝斯虫等病原感染后引起的一种急性发作的血液寄生虫病,导致病牛出现贫血、高热、黄疸、血红蛋白尿等症状。以下介绍牛巴贝斯虫病的感染特点、流行病学、临床症状及防治措施,供养殖户参考。一、巴贝斯虫病感染特点。巴贝斯虫有多个种类,其中我国已报道可感染牛的有3种,分别是双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫,它们都有多形性的特点,且虫体大小不一。

牛巴贝斯虫新疆株MSA-2c基因重组质粒的构建、真核表达及其免疫反应性研究

根据GenBank公布的牛巴贝斯虫裂殖子表面抗原MSA-2c基因序列设计引物,采用PCR方法从患病牛的全血基因组中扩增得到798 bp的MSA-2c基因片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达MSA-2c基因,取其肝脏提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增可得到目的条带;用重组质粒pcDNA3.1(+)-MSA-2c肌肉注射免疫小白鼠4次后,将获得的抗血清作为抗体,纯化的GST-MSA-2c融合蛋白作为抗原进行Western-blot检测,可得到抗原-抗体结合产生的特异性条带,表明重组质粒具有免疫学活性。

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的初步建立

以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法。方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5μg/mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。

牛巴贝斯虫实时荧光PCR检测方法的建立

为建立牛巴贝斯虫(B.bovis)的TaqMan实时荧光PCR检测方法,本研究根据GenBank中B.bovis的18S rRNA基因保守序列,设计引物和TaqMan探针,通过优化反应体系,建立检测B.bovis的实时荧光PCR方法。试验结果表明:实时荧光PCR对靶基因的最低检测值为1.31×101copies/μL,比常规PCR的敏感性高1 000倍;而且与牛的其他血液原虫无交叉反应;组内及组间重复性试验的变异系数均小于3%,具有良好的重复性;在23份被检样品中,实时荧光PCR和常规PCR的检出率分别为52.17%和30.43%。该检测方法的建立为B.bovis的检测提供了一种快速、敏感、特异的技术手段。

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学诊断方法的建立

【目的与方法】在优化表达牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白和建立ELISA反应条件的基础上,进一步探讨牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白及其所建立的ELISA检测方法的特异性,从而建立牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法。【结果】牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA检测方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的阳性符合率为96%。【结论】所建立的GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法重复性好、特异性强、灵敏度高。这是国内首次利用重组蛋白抗原建立的牛巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。

新疆牛巴贝斯虫病的流行病学调查

【目的】2006～2008年对全疆14个地州的牛巴贝斯虫病进行流行病学调查。【方法】使用已建立的牛巴贝斯虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST-MSA-2作为抗原。【结果】(1)新疆存在着牛巴贝斯虫病。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清7份,感染率为2.52%。在2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清32份,感染率为3.13%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清43份,感染率为5.28%。(2)2008年在地方流行性疫病区牛巴贝斯虫感染率高达28%。(3)牛巴贝斯虫病所在的地州由2006年的5个扩大到2008年的11个。【结论】新疆牛巴贝斯虫病的感染率逐年上升,疫区面积不断扩大,流行区内感染率激增,牛巴贝斯虫病的防治不容忽视。这是新疆首次利用血清学方法对全疆牛巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查。

二重PCR快速检测牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的研究

根据伊氏锥虫ITS序列(FJ416612)和GenBank报道的牛巴贝斯虫棒状结合蛋白1序列(FJ588013),设计合成2对特异性诊断引物,建立了牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的二重PCR诊断方法。结果表明,建立的二重PCR诊断方法可扩增出牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的特异性条带,大小分别为213bp和360bp,最低检出量分别为4.00pg和0.38pg。但对牛双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫、环形泰勒虫、附红细胞体、巴氏杆菌不敏感。用该二重PCR方法对95份水牛样品和134份奶牛样品进行检测,结果发现,水牛伊氏锥虫的感染率为13.7%(13/95)、牛巴贝斯虫的感染率为7.4%(7/95),无混合感染;奶牛伊氏锥虫的感染率为3.7%(5/134)、牛巴贝斯虫的感染率为0(0/134)。说明该二重PCR方法具有敏感、快速、特异的特点,适用于牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的流行病学调查。

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离

本试验对感染双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合种的牛连续注射1％台盼蓝溶液3天,用其脑匀浆滤液接种健康易感牛,未分离出牛巴贝斯虫单一种。将洁净微小牛蜱幼虫释放到牛体叮咬10天后,用混合种含虫血感染牛,收集饱血雌虫,置28℃、相对湿度约90％的条件下产卵孵化,用次代幼虫分批感染健康易感牛5头,准确地于幼虫释放后5、4、3天,用杀虫剂杀死正在吸血的幼虫终止感染,对试验牛逐日耳尖采血涂片检查,仅3天杀死幼虫的牛只感染有牛巴贝斯虫单一种。试验结果表明,台盼蓝不能杀灭双芽巴贝斯虫;脑涂片中尽管有大量牛巴斯虫,但它不是寄生于该部位的唯一种;叮咬3天的次代幼虫仅传播牛巴贝斯虫。

牛巴贝斯虫PCR检测及体外培养试验

本试验通过PCR方法检测出牛巴贝斯虫单一感染的牛全血样本,并探讨了牛巴贝斯虫病患牛全血体外培养方法及培养条件。试验结果表明,PCR检测结果显示检测方法效果较好,单一感染样本的新鲜血液中虫体在含40%牛血清的完全培养液和37℃5、%CO2的条件下能建立起牛巴贝斯虫的体外培养,虫体可以连续培养14 d,传代13次,最高染虫率可以达到12.5%,平均染虫率为4%。

新疆牛巴贝斯虫MSA-2c可溶性融合蛋白的高效表达

为了提高新疆牛巴贝斯虫MSA-2c融合蛋白在大肠杆菌中的表达量,研究了不同表达条件对蛋白表达量的影响,包括温度、诱导时间以及诱导剂(IPTG)浓度等。结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养约2.5 h后,添加终浓度为1 mmol/L的IPTG,在27℃振荡培养8 h时,GST-Tamsl融合蛋白表达量最高,达到3.2mg/mL。用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对CST-MSA-2c融合蛋白进行纯化,SDS-PACE检测表明GST-Tamsl融合蛋白大小约为55 KD,与预期的分子量大小一致。MSA-2融合蛋白的优化表达为牛巴贝斯虫病的分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

水牛牛巴贝斯虫体外培养的研究Ⅱ．冷冻血清的应用和筛选

应用冷冻血清对１株采自自然感染的水牛牛巴贝斯虫进行了长达７２ｄ的体外连续培养，共继代２０次，培养７２ｈ红细胞染虫率最高达１４．１％，平均为８％～１０％。培养２０ｄ和３０ｄ的牛巴贝斯虫经液氮保存复苏后，接种于去脾水牛犊均引发了严重的牛巴贝斯虫病，从而说明已建立了水牛牛巴贝斯虫的体外连续培养，且经培养后的牛巴贝斯虫致病力没有改变。本试验利用６头份的冷冻健康水牛血清同时进行培养，结果发现，并非所有的健康水牛血清均适合于体外培养牛巴贝斯虫。

黄牛血液体外培养水牛牛巴贝斯虫的研究

从非巴贝斯虫病流行地区以临床检查健康，免疫学检查无巴贝斯虫感染的黄牛，分离血清和红细胞，分别与健康水牛红细胞和血清以不同的组合方式混合，采用改进的微气静相培养技术体外培养水牛牛巴贝斯虫，结果表明：黄牛红细胞不能作为寄生于水牛体内的牛巴贝斯虫体外培养的支持细胞，黄牛血清支持牛巴贝斯虫生长的能力明显低于水牛血清。这一发现对研究寄生于水牛体内的牛巴贝斯虫的生物学特性及牛巴贝斯虫病的免疫均具有重要意义。

牛巴贝斯虫病的研究进展

牛巴贝斯虫病(Babesiosis)是由梨形虫目(Piroplasmide)巴贝斯科(Babesicdae)巴贝斯属(Babesie)的若干巴贝斯虫种寄生在牛红细胞(RBC)内而引起一种世界性血液原虫病。本病首例患牛于1896年在美国南部的宾夕法尼亚洲发现的,病原体是由罗马尼亚学者Babes(1888年)从当地患牛血液中首先发现的。目前报道至少有18种巴贝斯虫对家畜、实验动物及人具有致病性,其中寄生于牛的巴贝斯虫有4种。

地高辛标记C15A核酸探针检测牛巴贝斯虫

为了提高牛巴贝斯虫核酸探针的检测性能，制备了地高辛标记的牛巴贝斯虫Ｃ１５Ａ核酸探针。该探针检测牛巴贝斯虫ＤＮＡ的灵敏度为３２ｐｇ，检测探针ＤＮＡ的灵敏度为０．１ｐｇ；检测其他对照血液原虫（双芽巴贝斯虫、边缘无浆体、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫、卵圆巴贝斯虫）和牛血细胞的ＤＮＡ，均未出现非特异性反应。与光敏生物素标记的牛巴贝斯虫Ｃ１５Ａ核酸探针比较，光敏生物素标记探针能检出１０％带虫血１２．５μＬ，而地高辛标记探针能检出１０％带虫血０．０１５μＬ，且杂交背景浅，显色深。

水牛牛巴贝斯虫低温保存和复苏后的致病力研究

将含水牛牛巴贝斯虫的压积红细胞与等量的１６％二甲基亚砜阿氏液混合后分装于冷冻管内，于液氮（－１９６℃）中保存。保存２６ｄ、７８ｄ、１４２ｄ和１４９ｄ后，在３８℃温水中复苏，经皮下、静脉和静脉皮下同时感染摘脾小牛获得成功。水牛感染后，外周血液出现虫体时间短的为５ｄ，其余的为８ｄ和９ｄ。血液涂片中发现典型的牛巴贝斯虫，最高染虫率（ＰＰＥ）为１５％。由低温保存的含虫血与新鲜虫血和蜱感染一样使水牛发病，出现高温稽留（最高体温达４１．３℃贫血、黄疸和血红蛋白尿等典型的症状，未经治疗均以死亡告终。本研究的成功为长期保存水牛巴贝斯虫株提供了简便而可靠的方法。

培养液容积、深度和更替时间对水牛牛巴贝斯虫体外培养的影响

采用改进的微气静相培养技术，研究了培养液容积、深度、更替时间对体外培养牛巴贝斯虫的影响。结果表明：培养液层深度对牛巴贝斯虫的生长繁殖影响明显，理想的液层深度是６．２ｍｍ；在保持单位面积上培养液容量不变的情况下，培养容积大小对培养无影响；隔２４ｈ更换上清液，能使牛巴贝斯虫稳定地生长，延长更换培养液的时间能显著地抑制牛巴贝斯虫的生长繁殖。试验还在此基础上，利用较大容积（１６．０ｍｌ）对１株牛巴贝斯虫进行了长达２７ｄ的体外培养，继代８次，牛巴贝斯虫生长良好。本试验的成功为进一步研究水牛巴贝斯虫病及其免疫提供了有利条件。

牛巴贝斯虫核酸探针研制和应用试验

对比不同方法制备牛巴贝斯虫Ｃ５１Ａ探针ＤＮＡ和光敏生物素标记的效果，建立ＥＣＯＲＩ酶切纯化的Ｃ５１Ａ探针制备技术。该探针除具备重组质量ＤＮＡ探针的特异性和灵敏度外，杂交效果更规律清晰。开始应用到流行地区奶牛血样检测。

用重组的牛巴贝斯虫棒状体蛋白1作为ELISA诊断抗原进行牛群中牛巴贝斯虫病的血清流行病学调查

用重组的牛巴贝斯虫棒状体蛋白1(Bc-RAP-1)作为ELISA诊断抗原,对采自青海省湟中县的120份奶牛血清样品,进行抗Bc-RAP-1特异性抗体的检测。结果检出7份阳性,阳性率为5.83%,说明该地区牛群存在牛巴贝斯虫的感染。