牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。

牛支原体新疆分离株重组P81膜蛋白的表达及鉴定

目的重组表达牛支原体P81膜蛋白,为研制牛支原体疾病诊断试剂提供研究基础。方法根据GenBank发表的牛支原体P81基因的编码序列,利用点突变试剂盒基于重叠延伸PCR原理设计5对引物,将P81基因的第165、690、1 455、1 674位编码色氨酸的TGA密码子分别突变为TGG,并连接到表达载体pET-32a(+),转化DH5α感受态细胞后经IPTG诱导表达目的蛋白,Western blot检测其反应原性。结果成功扩增出4处TGA突变为TGG的牛支原体新疆分离株P81基因,大小与预期值2 112bp一致。重组表达载体转化菌经IPTG 37℃诱导8h,表达分子质量单位(Mr)约94×103的目的蛋白,与预期相符。Western blot检测该蛋白能被抗P81多克隆抗体识别。结论成功构建重组牛支原体P81膜蛋白基因表达载体,获得的目的蛋白具有良好反应原性,为研发牛支原体病免疫诊断试剂奠定了基础。