山羊源牛无浆体对Balb/c小鼠感染性研究

牛无浆体(Anaplasma bovis)隶属无浆体属(Anaplasma),可感染动物单核细胞和组织巨噬细胞,对动物生产性能影响较大。用单核细胞分离方法得到山羊源牛无浆体,并将其接种至人工饲养的Balb/c小鼠,接种时分别设置高、中、低剂量组、阴性对照和空白对照。结果发现,高剂量组和中剂量组接种后3、6、9 d的血涂片检查和PCR扩增均可查到牛无浆体,9 d后转阴;低剂量组Balb/c小鼠不同时间点检查时牛无浆体均呈阴性。表明从山羊单核细胞直接分离牛无浆体可以感染Balb/c小鼠,接种9 d内可持续感染,为牛无浆体的动物感染模型的建立奠定了基础。

牛无浆体16S rRNA基因的克隆测序及分析

从自然感染无浆体的重庆黄牛无菌采集血液,提取全血基因组,用血营养菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1500bp的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序,并与5条边缘无浆体、4条中央无浆体、4条牛无浆体、4条羊无浆体和3条嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因序列进行系统发育分析。结果表明所克隆的基因片段长度为1412bp,GenBank登录号为FJ169957。序列比较结果显示,所获得的序列与Kawa-hara公布的牛无浆体日本株(AB211163)同源性最高,达到99.0%,系统发育分析发现,该序列被聚类到牛无浆体群,并与嗜吞噬细胞无浆体群聚类到一个大的分支。本文从分子水平证实重庆地区存在牛无浆体,牛无浆体与嗜吞噬细胞无浆体的亲缘关系比其他3种无浆体更近。

新疆革蜱源性牛无浆体的PCR检测

为了解新疆部分地区优势媒介革蜱类传播牛无浆体的状况,随机采集了吐鲁番、巴州等牛场和放牧牛身上寄生的革蜱(N=140只),以16S rRNA基因为靶标分别设计了无浆体属通用引物(EE1/EE2)和牛无浆体特异性引物(AB1f/AB1r),运用嵌套式PCR方法扩增其全基因组DNA。试验结果显示,在140只革蜱全基因组DNA中,扩增出阳性条带的13只,其牛无浆体的阳性率为9.3%(13/140),这结果被阳性革蜱同一个群的革蜱动物传播试验所验证。经阳性病原DNA的克隆测序、比对后,发现该牛无浆体病原DNA序列与数据库中的西藏株(AF414399)和福建株(DQ324547)相似,其同源性均为99%。试验表明,新疆牛无浆体可能被当地的优势媒介革蜱所携带和传播,该参数可为地方蜱传无浆体病的综合防治提供科学依据。

人工感染牛无浆体BALB/c小鼠内脏器官的组织病理学观察

为了解牛无浆体阳性动物内脏器官的病理变化,将牛无浆体人工接种至BALB/c小鼠,利用血涂片染色法和PCR法鉴定感染情况,对感染牛无浆体的BALB/c小鼠内脏器官做组织病理学观察。结果表明,牛无浆体可引起BALB/c小鼠心脏的心肌细胞嗜酸性增强、胞核固缩,肝脏的肝细胞中重度颗粒变性,脾脏的淋巴细胞形态不规则等病变。本研究表明,感染牛无浆体的BALB/c小鼠的内脏器官和心、肝、脾等均产生了不同程度的病理学变化,为牛无浆体的致病性研究提供了参考数据。

新疆南疆绵羊牛无浆体病的流行病学调查

为了调查新疆南疆地区绵羊牛无浆体病的流行情况,试验从南疆喀什、和田、阿克苏和巴州四个地区21个县市采集绵羊血液样品共637份。以巢式PCR扩增绵羊血液样品中牛无浆体的16S rRNA特异性片段。PCR扩增片段为551 bp的样品为阳性样品,表示感染了牛无浆体。结果表明:新疆南疆绵羊牛无浆体的总体感染率为52. 9%,其中喀什、和田、阿克苏、巴州地区的感染率分别为55. 3%、53. 3%、51. 3%、43. 3%。说明新疆南疆绵羊牛无浆体的感染率较高,为绵羊牛无浆体病的诊断和防控提供流行病学资料。

环形泰勒虫与牛无浆体双重PCR方法的建立

旨在建立快速检测环形泰勒虫和牛无浆体的双重PCR方法,调查吐鲁番地区这2种病原感染情况。根据NCBI库中上传的环形泰勒虫Spm2、Tams1基因和牛无浆体16S rRNA基因保守序列设计、合成3对特异性引物,使用PCR扩增并测序。根据Spm2和16S rRNA基因设计双重PCR并对反应体系及条件进行优化,对该方法进行特异性、灵敏性和重复性检测,建立一种双重PCR方法。结果显示,双重PCR方法特异性扩增出环形泰勒虫和牛无浆体相应目的片段,片段大小分别为853,351 bp,而驽巴贝斯虫、马泰勒虫、绵羊无浆体和伊氏锥虫均未扩增出条带。对环形泰勒虫Spm2、Tams1和牛无浆体16S rRNA基因序列进行系统发育分析,环形泰勒虫Spm2基因序列与印度株同源关系最近(MH844677)、Tams1基因序列与突尼斯株同源关系近(AF214899),牛无浆体16S rRNA基因序列与突尼斯株同源关系近(KY655808)。此方法能检测环形泰勒虫与牛无浆体最低浓度分别为2.9×10^(-16),1.8×10^(-19)g/μL。用该方法对临床60份牛血DNA进行双重PCR扩增,其中环形泰勒虫阳性率为66.7%(40/60),牛无浆体阳性率为53.3%(32/60),混合感染阳性率为43.3%(26/60)。双重PCR方法与已建立的环形泰勒虫和牛无浆体单一PCR方法检测结果的符合率为93.3%。成功建立了一种能同时检测2种病原的双重PCR方法。

中国南方七省份牛无浆体病的流行病学调查

为了调查我国南方地区牛羊感染牛无浆体的状况,用PCR检测了采自四川、重庆、云南、贵州、广西、湖南、广东等七省(区、市)共685份牛和羊的血液样品的DNA。PCR方法以16SrRNA基因为靶标,采用无浆体属通用引物EE1/EE2和牛无浆体特异性引物AB1f/AB1r对采集样品的全血基因组进行套式PCR扩增。PCR结果显示:四川省样品感染率为17.5%;重庆市样品感染率为25.7%;云南省样品感染率为29.6%;贵州省样品感染率为59.1%;广西壮族自治区样品感染率为14.0%;湖南省样品感染率为8.2%;广东省样品感染率为23.7%。调查证实了牛无浆体在我国南方地区有广泛的分布,该调查丰富了我国牛无浆体的流行病学资料。

牛无浆体和山羊无浆体双重PCR检测方法的建立

无浆体是一种专性血液寄生的可经硬蜱传播的病原体,世界范围内分布广泛。本研究旨在建立一种可以同时检测牛无浆体和山羊无浆体的双重PCR方法。通过对2种病原gltA基因和msp4基因位点引物的筛选,PCR反应体系中引物剂量、酶剂量和PCR反应条件中的退火温度、循环次数的优化,最终确定了一个引物组合和最适的PCR反应体系和条件,并对其进行了重复性和特异性验证。结果表明,本研究建立的双重PCR方法有效,操作简便、特异性、重复性良好,为兽医工作者和科研人员提供了一种山羊无浆体和牛无浆体感染快速鉴别诊断和流行病学监测工具。

南疆部分地区高山牦牛牛无浆体的PCR检测

为了解南疆部分高山牦牛感染牛无浆体的情况,将2018年采集于巴音郭勒蒙古自治州哈尔诺尔牧场和喀什塔什库尔干塔吉克自治县的牦牛血样,以16S rRNA基因通用引物对提取的牦牛全血DNA进行PCR检测,并测序鉴定。结果显示,成功扩增了约1 500 bp左右的目的片段;哈尔诺尔牧场牦牛无浆体感染率为61.1%,塔什库尔干塔吉克自治县牦牛无浆体感染率为62.5%;阳性片段与基因库已记载的韩国牛无浆体相似性为98%,进化树分析显示与牛无浆体聚为一支。本研究为新疆高山牦牛无浆体病的防控提供依据。

牛无浆体PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的牛无浆体(Anaplasma bovis)PCR检测方法及了解新疆部分地区牛无浆体感染情况,根据牛无浆体16S rRNA基因序列(MH255941.1)设计1对引物,建立了检测牛无浆体PCR方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验、临床样品检测及系统进化分析。结果显示,所建立的方法能特异性地鉴别牛无浆体,与环形泰勒虫(Theileria annulata)、绵羊无浆体(A.ovis)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B.bigemina)基因组均无交叉反应,该方法检测下限可达到1.02×10^(-18)g/μL,比文献报道的PCR敏感10倍(8.9×10^(-18)g/μL);具有良好的重复性;对94份牛临床血液样品检测结果表明,牛无浆体的阳性率为54.3%(51/94),高于文献报道的PCR方法的检测结果37.2%(35/94);系统进化树显示,三个地区的牛无浆体菌株都不在同一分支上。结论,成功构建了牛无浆体PCR快速检测方法,这为牛无浆体的快速诊断及流行病学调查奠定基础。

新疆部分地区牛梨形虫和无浆体感染情况调查分析

为了解新疆吐鲁番与阿勒泰地区牛梨形虫及牛无浆体的感染率和种类,采用聚合酶链反应(PCR)技术对两地区随机采集的120份牛血样品进行了泰勒虫、巴贝斯虫及无浆体的病原检测,对感染率进行统计学分析,并对其系统发育进行分析。结果显示,牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫及牛无浆体感染率分别为20.8%(25/120)、14.2%(17/120)和11.7%(14/120),其中28头牛感染2种~3种病原,呈混合感染。调查结果可为上述两地区泰勒虫病、巴贝斯虫病及无浆体虫病防控提供参考。