牛星状病毒病研究进展

牛星状病毒(Bovine Astrovirus,BoAstV)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒。1978年,BoAstV首次在英国的犊牛腹泻粪便样本中被发现,此后在许多其他国家都有报道。它具有广泛的组织嗜性,在肠道、呼吸道和神经系统均可检测到病毒。由于BoAstV在无症状牛和临床感染牛中普遍存在,且通常与其他病毒存在共感染模式,因此BoAstV的致病性尚不清楚。目前越来越多的流行病学研究表明,BoAstV与犊牛腹泻、脑炎的症状相关,国内对BoAstV的关注日益增加。本文对BoAstV的病原学、流行病学、致病性、共感染、诊断方法和综合防控措施进行综述,为BoAstV的研究及综合防控提供参考。

牛星状病毒和牛诺如病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立能同时快速检测牛星状病毒(BAstV)和牛诺如病毒(BNoV)的方法,本研究根据BAstV ORF1a基因和BNoV RdRp基因设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测BAstV和BNoV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对牛轮状病毒等5种犊牛腹泻常见病原的扩增结果均为阴性,仅BAstV和BNoV扩增结果为阳性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对BAstV和BNoV重组质粒的最低检测限分别为1.09×10^3拷贝/μL和1.42×10^3拷贝/μL,敏感性较高;批内和批间试验结果一致,该方法重复性好。利用该方法和各病原单一PCR方法同时对221份河南省犊牛腹泻粪便样品进行检测,BAstV和BNoV的阳性检出率分别为18.1%和9.96%,两种方法符合率为100%。本研究在国内首次建立了检测BAstV和BNoV的双重PCR方法,其特异性强,敏感性高,重复性好,为BAstV和BNoV的鉴别检测及其分子流行病学调查提供了技术支持。

广西地区水牛群牛星状病毒分子流行病学调查

试验旨在了解2019年广西地区牛星状病毒(bovine astrovirus,BoAstV)在水牛群中的流行情况及毒株序列特征,并进行遗传进化分析。从2019年广西南宁、贵港、北海、横县、灵山5个地区15个水牛场共采集297份水牛粪便样品,使用Trizol法抽提样本总RNA后,利用半巢式RT-PCR方法对收集到的粪便样品进行检测,并将阳性样品连接到pMD18-T载体进行测序,对测序结果进行同源性分析及系统进化树构建。结果显示,BoAstV感染的水牛场阳性率为40.00%(6/15),样品总阳性率约为11.11%(33/297),1~180日龄犊牛感染率最高为18.75%(27/144);有19株BoAstV ORF1b基因测序成功,核苷酸序列同源性为53.9%~99.3%,氨基酸序列同源性为12.1%~98.5%。遗传进化分析发现,广西地区流行的BoAstV主要分为4个亚群:第一亚群是NNC-286、HX-3、HX-4和NNA-14,与新型的神经嗜性的牛星状病毒BoAstV NeuroS1和BoAstV BH89/14等Mamastrovirus 13亚群的序列之间有较高的亲缘性;第二亚群是NNA-12、NNA-13、NNA-17、NNA-11,与水牛星状病毒(buffalo astrovirus)亲缘性较近,属于水牛星状病毒分支内;第三亚群是HX-1、HX-5、HX-6和BH-C22,与经典的牛星状病毒毒株BoAstV B170-HK亲缘性较近;第四亚群包含NNA-7、NNA-15、NNA-6、NND-S2、NND-S16、NNC-296与BH-C14,与广西BoAstV地方流行毒株的亲缘性较近。不同基因型BoAstV感染了广西不同地区的水牛群体,本试验在广西地区发现了类神经嗜性BoAstV毒株感染水牛的情况,为进一步全面了解该病毒的流行病学和生物学特性提供参考。

牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用多重荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法,提高对多病原检测的速度和灵敏度,促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒(BAstV)ORF2基因,牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)5′端非编码区,牛冠状病毒(BCV)N pro基因和牛轮状病毒(BRV)VP6基因的保守基因序列设计、合成并试验筛选了四对有效的特异性引物和探针。进一步利用含4种病毒目的片段的重组质粒,对引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,建立了Real-time RT-PCR标准曲线,并对四重Real-time PCR方法的特异性、敏感性、重复性和各种临床样本的适用性进行了评价。结果显示:Real-time RT-PCR最适退火温度和时间分别为50.0℃和45 s,BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物浓度分别为300、300、400和500 nmol·L^(-1),探针浓度分别为250、150、100和300 nmol·L^(-1)。对BVDV-1、BCV和BRV的最低检测限均为102copies·μL^(-1),对BAstV的最低检测限为103 copies·μL^(-1),具有良好的特异性和重复性。该方法对临床采集的粪样的阳性检出率高于PCR方法。上述结果表明,建立的四重Real-time RT-PCR方法可以用于犊牛腹泻常见病原BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的快速鉴别诊断。

牛星状病毒ORF2基因遗传进化分析及原核表达

为了解牛星状病毒(bovine astrovirus,BoAstV)ORF2基因的遗传进化并获得原核表达的衣壳蛋白,从牛腹泻粪便中提取总RNA,扩增BoAstV ORF2基因,将ORF2基因克隆至pMD19-T载体中并测序,利用生物信息学软件分析基因的遗传进化。将位于BoAstV衣壳蛋白高度保守区的ORF2-1200基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-ORF2-1200。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达并优化诱导条件,经过超声破碎离心并鉴定蛋白可溶性,最后利用亲和层析镍柱对重组蛋白进行纯化和Western blot鉴定。结果表明:ORF2基因全长2304 bp,编码768 aa,ORF2基因属MAstV-28基因型,与日本毒株Ishikawa24-6亲缘关系最近,与20个参考毒株的ORF2基因氨基酸同源性为53.2%~86.0%。试验成功构建了重组载体,经条件优化,在37℃,1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小55 kDa左右,目的蛋白以包涵体形式存在,Western blot检测目的蛋白正确表达。本试验通过分析BoAstV ORF2基因的遗传进化情况,明确MAstV-28型BoAstV在中国的流行;对ORF2基因保守区域进行克隆和原核表达及纯化,成功获得了重组蛋白,为深入研究蛋白功能和建立BoAstV血清学检测方法奠定了基础。

重庆肉牛腹泻相关病毒的检测及遗传进化分析

为了解重庆市肉牛病毒性腹泻的病原流行情况,本研究对重庆市8个肉牛养殖场的81份腹泻粪便样本中牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)和牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)4种致腹泻病毒进行了RT-PCR检测,对PCR产物进行测序,用Mega 6.0软件进行系统发育分析。结果显示,BRV、BAstV和BVDV检出率分别为66.7%、8.6%和7.4%,BCV未检出。遗传进化分析结果表明,测序的5个BRV单独聚为一小支,与GenBank中其他VP6序列有明显的遗传距离;BVDV与中国株和丹麦株聚为一支,遗传关系最近;5个BAstV单独聚为一支,与中国香港株遗传关系最近,但仍有明显的遗传距离。本试验结果表明,重庆地区肉牛腹泻主要发生在6月龄以下犊牛,BRV是该地区肉牛腹泻的重要原因,BRV、BAstV和BVDV 3种病毒的遗传多样性值得进一步关注。

青海西宁牦牛病毒性腹泻疫病病原学调查与分析

为掌握青海省西宁市牦牛群中病毒性腹泻疫病各种致病原的流行情况,本试验采用RT-PCR方法 对西宁市74份腹泻牦牛粪便样品进行了BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的病原学检测与分析,结果显 示:西宁市大部分地区均存在BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的流行,以湟源县的流行最为严重,BVDV 、BRV、BEV、BCV、BAstV平均阳性感染率分别为37.84%、27.03%、22.97%、5.41%、2.70%,以BVDV 的感染最为严重。共存在BVDV、BRV、BEV、BAstV 4种单感型以及BVDV/BRV、BVDV/BEV、BVDV/BCV 、BRV/BEV、BRV/BCV、BVDV/BRV/BEV、BVDV/BRV/BCV 7种混感型,混合感染型较多,混合感染情况较 复杂。表明青海省西宁市牦牛病毒性腹泻中存在多种致病原的单独感染以及混合感染,且混合感染 现象严重,为西宁市牦牛病毒性腹泻疫病的综合防控积累了资料。

牛星状病毒和牛病毒性腹泻病毒及牛传染性鼻气管炎病毒三重荧光PCR方法的建立与应用

为快速同时检测牛星状病毒(BAstV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),本研究针对BAstV基因组ORF1a基因、BVDV基因组多聚蛋白基因和IBRV基因组g B基因的保守区域各设计特异性引物和探针,经反应体系和扩增程序优化,建立了BAstV、BVDV和IBRV三重荧光PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并应用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该方法可扩增BAstV、BVDV和IBRV的核酸,不能对多杀性巴氏杆菌(Pm)、B型牛鼻炎病毒(BRBV)、口蹄疫病毒(FMDV)等病原的核酸进行扩增,特异性较强;对BAstV、BVDV和IBRV的最低检测限(LOD)均为305copies/μL,敏感性较高;检测BAstV、BVDV和IBRV的组内、组间重复性试验变异系数(CV)值均小于3%,重复性较好。应用该方法检测100份临床样品,BAstV、BVDV、IBRV的阳性检出率分别为0、11%、6%。本研究建立的三重荧光PCR方法具有敏感性高、特异性强、在同一反应体系中可以快速鉴别检测BAstV、BVDV、IBRV等优点,可应用于临床BAstV、BVDV、IBRV感染的检测。

牛诺如病毒、牛星状病毒和牛环曲病毒多重PCR检测方法的建立及应用

为建立能同时检测牛诺如病毒(BNoV)、牛星状病毒(BAstV)和牛环曲病毒(BToV)的方法,根据BNoV、BAstV和BToV基因组的保守区域设计3对特异性引物,预期特异性扩增BNoV、BAstV和BToV的片段大小分别为542,376,698 bp,建立了BNoV、BAstV和BToV的多重PCR检测方法。结果显示,该方法能特异性扩增BNoV、BAstV和BToV的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病原;BNoV、BAstV和BToV的最低检测限分别为1.34×10^4,1.06×10^4,1.03×10^4拷贝/μL。对采集自河南省的221份犊牛腹泻样品的检测结果显示,BNoV、BAstV和BToV的检出率分别为9.96%(22/221),18.10%(40/221)和19.00%(42/221)。三者与单一PCR检测结果相一致。结果表明,本试验建立的多重PCR方法可用于BNoV、BAstV和BToV的检测和流行病学调查。

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10^(1)~1.36×10^(8)拷贝/μL线性关系良好,相关系数R^(2)=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。

牛星状病毒及牛环曲病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能同时快速检测牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)和牛环曲病毒(bovine torovirus,BToV)的方法,本研究根据BAstV的ORF1a和BToV的S基因的保守区域分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测BAstV和BToV的双重RT-PCR方法。特异性结果显示,该方法与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRo V)、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对BAstV和BToV质粒标准品的最低检出下限分别为1.12×10~4copies/μL和1.0×10~3copies/μL。应用该方法和各病原RT-PCR方法同时对221份河南省犊牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BAstV的阳性率为18.1%,BToV的阳性率为19%,其中BAstV和BToV共感染的阳性率为6.79%,双重RT-PCR方法和各病原RT-PCR方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重RT-PCR方法可用于BAstV和BToV的病原监测及流行病学调查。

牛星状病毒神经型与肠道型ORF2蛋白原核表达及间接ELISA的建立与初步应用

通过GenBank中登录号(神经型BufAstV-GX-NN-ORF2-14、肠道型BufAstV-GX-NN-ORF2-12)合成神经型ORF2-14-1与肠道型ORF2-12-1基因序列,运用PCR技术扩增神经型ORF2-14与肠道型ORF2-12目的片段的基因并克隆到pET-32a(+)载体,成功构建了重组质粒神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12,经鉴定正确后转化BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。以纯化的神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12重组蛋白为诊断抗原,成功建立牛星状病毒(bovine astrovirus,BoAstV)神经型与肠道型的间接ELISA抗体检测方法。运用建立的间接ELISA对2019-2020年广西部分地区采集的712份牛血清进行BoAstV抗体的检测,结果显示肠道型共检出170份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为23%;神经型共检出124份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为17%;其中,2种型共同感染阳性率占总份数10%。结果表明,本试验成功建立了对BoAstV的神经型与肠道型分型检测方法,为临床上对BoAstV分型检测提供良好的检测方法打下基础。

青海省湟中县牦牛病毒性腹泻5种相关病原的检测与分析

为了掌握湟中县牦牛病毒性腹泻病原的流行现状,对湟中县内11个乡镇的138份腹泻牦牛粪便样品进行了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)和牛星状病毒(BAstV) 5种病毒性腹泻致病原进行检测与分析。结果:BVDV、BEV、BRV、BCV和BAstV的平均感染率分别为44. 93%、21. 74%、8. 70%、5. 07%和6. 52%,5种病原中BVDV和BEV在所有乡镇均有流行,BRV、BCV、BAstV在部分乡镇呈散发性流行; 5种病原在1～6月龄犊牦牛中的检出率明显高于6月龄以上成年牦牛。138份腹泻牦牛中存在BVDV、BEV、BRV、BCV、BAstV的单独感染和混合感染,总单感率为53. 62%;共存在10种混感型,总混感率为15. 22%。表明湟中县牦牛存在BVDV、BEV、BRV、BCV和BAstV的感染,且混合感染情况复杂,应引起高度重视。