牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株CQ2和弱毒株CQ6毒力相关基因分析.

为探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株(PmCQ2)与弱毒株(PmCQ6)其所含毒力基因的差异,本研究选择了多杀性巴氏杆菌17个与毒力相关的基因(tbpA、hgbA、hgbB、tonB、ptfA、pfhA、nanB、nanH、toxA、oma87,sodA、sodC、fimA、hsf-1、tadD、pmHaS、hadA)进行检测。试验结果显示,所检测的17个毒力相关基因中,有14个基因在PmCQ2和PmCQ6中都存在,tox A和hgb B基因在两菌株中均未检出,tadD基因仅存在于PmCQ6中。以上结果提示,CQ2株与CQ6株之间的毒力差异原因可能是:除上述所检测的毒力相关基因外,可能还存在其他毒力相关基因;二者毒力基因的表达调控存在差异。

牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的SSH法筛选

近年来由于牛的频繁调运,由牛源A型多杀性巴氏杆菌引起的牛肺炎型疾病呈现出流行趋势。为探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株间的基因差异,本研究利用抑制消减杂交技术(SSH)对牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株Pm CQ2和弱毒株Pm CQ6进行试验分析,共得到28个差异基因片段,测序比较发现其中27个与毒力、代谢、转录及DNA合成相关的基因片段,另1个基因片段所编码的为假定蛋白。该结果为牛源A型多杀性巴氏杆菌的后续致病机制研究提供了参考。

6株牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2010年～2011年，重庆市多处肉牛场发生牛呼吸道感染致死性病例。从病牛肺组织中分离到多株病原细菌，经细菌形态和培养特性观察、生化试验、小鼠致病性试验及细菌16S rRNA 序列测定，其中6株初步鉴定为多杀巴氏杆菌（Pm）；进一步采用Pm种型特异性基因Kmt-1及hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD PCR扩增，确定该6株Pm均为A型，分别命名为PmCQ （1～6）。对其部分生物特性比较分析表明，6株Pm在马丁肉汤和脑心浸液培养基中生长良好，PmCQ6相比其他几株菌平板培养菌落偏小；小鼠半数致死量（LD50）测定，PmCQ2毒力最强（2.2×10^5 cfu），PmCQ6毒力最弱（1.14×10^8 cfu）；药敏试验表明，6株菌对四环素、丙氟哌酸等多种药物敏感，无明显耐药性。

牛源A型多杀性巴氏杆菌培养特性和免疫原性的研究

为了确定牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm)的培养特性,本研究采用脑心浸液(BHI)培养基分别于静止、75r/min、250r/min3种培养转速对Pm进行培养,并与加血BHI进行比较,通过绘制生长曲线和小鼠毒力试验对Pm的培养基和培养转速条件进行优化,确定最佳培养条件为,以37℃,0.1%全血脑心浸汤(MB-HI)培养基,75r/min培养16h。将培养的A型Pm灭活后,免疫SPF小鼠,同时设立B型Pm灭活苗免疫组,攻A型Pm后的结果显示,A型灭活菌的保护率为100%,而B型灭活苗免疫组全部死亡。本研究通过对牛源A型Pm培养特性和免疫原性的研究,为新型牛出血性败血症灭活疫苗的研制提供了实验依据。

牛源A型多杀性巴氏杆菌pm 0979和pm 0442基因编码蛋白对小鼠的免疫保护性研究

为评价牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm)pm0979和pm0442基因编码蛋白的免疫保护效果,本研究以牛源PmCQ2株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到pm0979、pm0442全长基因,将其分别克隆到pET-30a、pET-32a载体并转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,分别获得大小约41.8 ku(rPM0979)和21.6 ku(rPM0442)的重组蛋白;将其亲合层析纯化后分别免疫小鼠,以PmCQ2株进行攻毒试验,测定其抗体产生情况和保护效果。结果表明,两种重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高水平的抗体;其中rPM0979对小鼠的免疫保护高于rPM0442,保护率可达60%。结果表明,重组蛋白PM0979可作为Pm的一种疫苗候选蛋白,为进一步的疫苗研制奠定了基础。

河西走廊牛源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的制备及临床效果检测观察

根据牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的培养特性,本研究采用脑心浸液肉汤（BHI）培养基静止培养24 h,每2h震荡一次的方法进行培养,将培养的A型多杀性巴氏杆菌灭活后制成A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗,免疫小白鼠和日本大耳白家兔.结果显示：A型灭活苗的保护率为100％;将制备的灭活疫苗进行肉牛安全性试验,均未发现过敏反应等异常情况;在河西走廊嘉峪关、酒泉、张掖、金昌和武威5市应用对网牛春（2～3月）、秋（10～11月）两季分别免疫注射制备的A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗,剂量为体重100 kg以上6 mL/头,100 kg以下4 mL/头的方法进行了较大规模的临床效果观察,免疫牛均未发现不良反应,实验组牛巴氏杆菌病发病、死亡率分别分别比对照组低2.4、1.99个百分点,差异极显著（p＜0.01）.

河西走廊牛源A型多杀性巴氏杆菌药物敏感性及临床疗效试验观察

抗菌药物对于细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但是在养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药物，不仅可使许多致病性细菌产生耐药性，造成药物的浪费，而且还会延误病情，给养殖业造成较大的经济损失。同时，随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果也越来越差。因此，选用正确的治疗抗菌药物不仅可提高疗效，而且还可避免和降低动物的耐药性，这就需要利用药敏试验进行药物敏感度的测定，以便确定有效的药物进行治疗。

牛源A型多杀性巴氏杆菌(Pm12)灭活疫苗的制备及小鼠攻毒保护试验

为了防控新疆北疆A型多杀性巴氏杆菌(Pm)引起的牛纤维素性化脓性肺炎,分析制备的A型Pm12灭活疫苗在试验小鼠体内抗体产生情况和保护作用,试验按细菌灭活疫苗制备程序将分离筛选自新疆北疆部分地区发病牛场的1株毒性强、免疫原性好的牛源A型Pm12制备成灭活疫苗,并进行安全检验。根据棋盘法对全菌抗原包被浓度、封闭液、血清稀释度、酶标二抗工作浓度、封闭时间、一抗孵育时间、二抗孵育时间及底物反应时间等检测条件进行筛选,建立检测小鼠血清抗体的间接ELISA方法,用建立的间接ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体产生规律,对免疫小鼠以不同半数致死量(LD50)的Pm12进行攻毒保护试验,同时用A型和B型Pm对免疫小鼠进行交叉保护试验。结果表明:制备的牛源A型Pm12灭活疫苗含菌量为8×109cfu/mL,安全检测合格。根据棋盘法确定全菌抗原包被浓度为1∶25,最佳血清稀释度为1∶320~1∶640,最适封闭液为5%BSA,最适封闭时间为1 h,血清最适作用时间为1 h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000,底物最适作用时间为15 min;用制备的疫苗免疫小鼠后,60天的血清抗体效价均高于28天水平;Pm12灭活苗对不同LD50攻毒小鼠的保护率为80%、80%、50%,对A型Pm保护率为80%,对B型Pm的交叉保护率为60%。说明可用试验建立的方法检测小鼠血清抗体水平,制备的牛源A型Pm12灭活疫苗能够诱导小鼠产生较高水平且持续较长时间的血清抗体,能够有效保护小鼠对抗A型Pm感染,且对B型Pm呈现部分交叉保护作用。

牛源A型多杀性巴氏杆菌培养特性和免疫原性的研究

为了确定牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌（Pm）的培养特性，本研究采用脑心浸液（BHI）培养基分别于静止、75转／分钟、250转／分钟3种培养转速对Pm进行培养，并与加血BHI进行比较，通过绘制生长曲线和小鼠毒力试验对Pm的培养基和培养转速条件进行优化，确定最佳培养条件为，以37℃，0．1％全血脑心浸汤（MB—HI）培养基，75转／分钟培养16小时。将培养的A型Pm灭活后，

1株牛源D:L3:L5型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及病原特性评价

【目的】通过探讨青海省西宁市某规模化奶牛场病死牛源多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型、耐药性和毒力基因分布情况,为多杀性巴氏杆菌引起的牛呼吸道疾病的治疗和预防提供参考。【方法】对病死牛肺脏样本进行细菌分离,通过菌落观察和染色镜检、生化鉴定、特异性引物扩增、16S rRNA测序分析及系统发育树构建、荚膜血清及脂多糖分型、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验对分离菌进行鉴定和病原特性评价。【结果】肺脏样本中分离得到的菌落呈现灰白色中间微凹陷的露珠样,未出现溶血环;革兰染色可见粉红色球杆菌;瑞氏染色可见两端浓染的蓝色球杆菌。生化鉴定结果显示,分离菌株D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、酪氨酸芳胺酶、磷酸酶、COURMARATE和ELLMAN反应结果为阳性;16S rRNA测序结果显示,分离菌株与多种多杀性巴氏杆菌相似性>95%,鉴定分离得到的菌株为多杀性巴氏杆菌,命名为XN222。荚膜血清分型及脂多糖分型结果显示,分离菌株XN222的荚膜血清分型为D型,其脂多糖分型为L3和L5型。毒力基因扩增结果显示,分离菌株XN222携带ptfA、fimA、hsf-2、sodA、tbpA、sodC等共计19种毒力基因。小鼠致病性试验结果显示,注射0.2 mL 1.5×10^(8)CFU/mL菌液,可导致100%(10/10)小鼠死亡,说明分离菌株XN222具有较强的致病能力。药敏试验结果显示,分离菌株XN222对头孢噻呋、左氧氟沙星、恩诺沙星、马波杀星、四环素和青霉素等15种抗菌药均敏感,对泰乐菌素中度敏感。【结论】本研究分离获得1株致病力较强的D型多杀性巴氏杆菌,该菌株的发现丰富了国内牛源多杀性巴氏杆菌亚型,可为多杀性巴氏杆菌引起的牛呼吸道疾病的防治、病原学调查和巴氏杆菌多价苗研制等提供生物素材。

西藏那曲市牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及基因组分析

旨在对引起西藏牦牛呼吸道感染的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定,明确病原菌的血清型、耐药性和致病性等生物学特性及基因组特征和遗传进化关系。本研究从西藏林芝、拉萨、那曲地区采集牦牛鼻咽拭子和组织病料498份,进行流行病学调查、细菌学分离纯化、生化试验、PCR鉴定、K-B药敏试验、动物致病性试验和分离株全基因组测序,并通过Mauve软件和MEGA 7软件进行基因共线性和系统进化分析。结果显示,经细菌分离纯化、生化试验及PCR鉴定,发现在西藏林芝、拉萨、那曲地区巴氏杆菌阳性率为2.61%,且从病死牦牛肺组织中分离出B型多杀性巴氏杆菌菌株,命名为“Pm XZ01”株;药敏试验发现Pm XZ01株对头孢菌素类、喹诺酮类、羧苄西林、丁胺卡那、复方新诺明和氯霉素类抗生素敏感;动物试验发现感染Pm XZ01株的家兔(1.2×10^(8) CFU·mL^(-1))和小鼠(1×10^(7) CFU·mL^(-1))死亡率高达100%,说明在该浓度下Pm XZ01株具有较强的致病性和致死性。全基因组测序获得Pm XZ01株全基因组大小为2331787 bp,GC含量为40.47%,重复序列总长度为3266 bp;含有121个非编码RNA基因,包括59个tRNA基因,19个rRNA基因,43个ncRNA基因;2个假基因,5个基因岛,3个前噬菌体,68个碳水化合物活性酶基因;CARD注释分析发现1个PBP3抗性基因和2个EF-Tu抗性基因;VFDB和PHI-base注释分析发现101个毒力因子相关基因及663个表型突变基因等;共线性分析发现Pm XZ01株与猪源HB03株(CP003328.1)、HN07株(CP007040.1)和禽源P1702株(CP097616.1)共线性最好,而与牦牛源Tibet-Pm1株(CP072655.1)共线性较差;系统进化树分析发现Pm XZ01株与中国广东牛源GDZQ201401株(KP083466.1)属于同一分支,进化关系最近。本研究完成了西藏牦牛巴氏杆菌病的流行病学调查,以及牦牛源B性多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、生物学特性和全基因组测序分析,为探索西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌病的流行规律和致病机制以及防控提供了参考。

绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌的生物学特性及2种候选疫苗的免疫效果评价

旨在研究新疆绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌(PmD)的生物学特性,探索其灭活疫苗与OmpH重组疫苗对小鼠的免疫保护效果,为防控新疆地区绵羊巴氏杆菌病提供参考。采用细菌分离鉴定、PCR鉴定、药敏试验、耐药与毒力基因检测、致病性试验等方法初步明确PmD的生物学特性;并通过最佳灭活条件和佐剂筛选、安全性试验、原核表达等方法制备PmD灭活疫苗与PmD-OmpH重组疫苗,采取小鼠攻毒保护试验评价2种疫苗的免疫效力。结果:从绵羊肺脏中分离出1株PmD,药敏试验显示,该菌为7重耐药菌,未检测到耐药基因;毒力基因检测显示,该菌具有12种毒力基因(exbB、exbD、hgbA、tonB、fimA、Oma87、OmpH、Psl、sodA、sodC、tbpA、toxA);致病性较强,对小鼠的最小致死菌量为2.2×105 CFU;灭活疫苗和重组疫苗对相同血清型菌株攻毒的保护率分别为80%和10%;灭活疫苗对血清型A、F和未知菌株攻毒保护率分别为0、20%和0,而重组疫苗的保护率则全为0。本研究发现1株强耐药、强毒力的绵羊源PmD,灭活疫苗对同种血清型菌株的保护性远高于重组疫苗,发病地区羊场可采用同种血清型灭活疫苗进行预防和控制绵羊巴氏杆菌病,对多价疫苗和新型疫苗的研制还有待进一步发掘。

肉鸡圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌混合感染的检测与分析

为查明福建省龙岩市某鸡场肉鸡消瘦、呼吸困难、病死率升高原因,对发病鸡进行细菌分离鉴定、16S rDNA鉴定、荚膜分型检测、药物敏感试验等分析;以及进行病毒核酸PCR检测、遗传进化分析。结果显示,从病鸡中分离的细菌在血平板上形成圆形、微突起、表面光滑、奶油状的菌落;分离菌16S rDNA核苷酸序列与GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌的同源性达到99.9%以上,菌株荚膜为A型;该菌对哌拉西林、头孢氨苄、庆大霉素等药物均表现为高度敏感;从病鸡中检测出圆圈病毒3型(GyV3)VP2基因,与GenBank(登录号MK089248)GyV3同源性最高(99.9%)。结果表明,该鸡场发生圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌引起的混合感染病例。

江苏省肉种鸡场禽多杀性巴氏杆菌流行病学调查

为了解江苏省禽多杀性巴氏杆菌流行情况,促进肉种鸡场的禽多杀性巴氏杆菌病防控,研究通过细菌鉴定方法、PCR检测、荚膜血清学分型、致病性分析以及药物敏感性试验,对分离自江苏省17个肉种鸡场的禽多杀性巴氏杆菌进行菌落形态、培养特性、生化发酵、荚膜型、菌落荧光型、药敏性等生物学特性研究,并对部分种鸡场进行血清学检测。结果显示:共鉴定13株禽多杀性巴氏杆菌,所有分离株荚膜分型均为A型,菌落荧光观察均属于强毒株;分离株对氨基糖苷类药物和氯霉素类药物具有一定的耐药性,而对β-内酰胺类药物高度敏感;确诊种鸡场阳性率显著高于未确诊种鸡场(P<0.01)。研究表明,江苏省部分地区肉种鸡场存在荚膜A型多杀性巴氏杆菌流行,强毒株比例较高,但耐药性较弱。

兔源F型多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

为建立特异性强且敏感性高的兔源F型多杀性巴氏杆菌(Pm)快速检测方法,本实验根据F型Pm fcbD基因的保守序列设计特异性引物和探针,经反应条件优化,建立了检测兔源F型Pm的荧光定量PCR方法。利用该方法检测兔源F型Pm、兔源A和D型Pm、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌等临床常见兔源病原菌,结果显示,该方法仅对兔源F型Pm检测为阳性,其余病原菌均为阴性,特异性强。利用该方法分别检测10倍倍比稀释(1×10^(8)拷贝/μL~1×10^(0)拷贝/μL)的兔源F型Pm基因组DNA,进行敏感性试验,结果显示该方法的检测限为10拷贝/μL,敏感性分别是已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的100倍和10倍,敏感性高。利用该方法对不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验,结果显示,批内和批间变异系数均小于3%,重复性好。利用该方法检测64份已知结果的临床样品,结果显示该方法的检测结果与已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法检测结果的符合率均为100%,准确性高。本研究首次以fcbD为靶基因建立兔源F型Pm的荧光定量PCR检测方法,为兔源F型Pm的检测提供了有力的技术手段。

兔源A型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种特异性强且敏感性高的兔源A型多杀性巴氏杆菌快速检测方法,本研究以兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因为目的基因,设计2对特异性引物进行双重PCR扩增,经反应条件优化,建立检测兔源A型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法。该方法的最佳退火温度为57.8℃,最佳混合引物浓度为0.8μmol/L。该方法特异性强,对兔源A型多杀性巴氏杆菌为kmt1和hyaD基因双阳性,对兔源D型和F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因单阳性,对兔源其它细菌性病原和阴性对照则均为阴性。该方法敏感性高,对兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因的最低检出限分别为1×10^(3)拷贝/μL和1×10^(4)拷贝/μL。该方法重复性好,且与已报道的多重PCR方法的符合率高达96.12%。本研究建立的双重PCR方法对兔源A型多杀性巴氏杆菌具有良好的特异性和敏感性,且重复性好、准确性高,为该病原的快速检测提供了有力的技术支持。

重组牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性研究

为鉴定多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性,本研究从牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌PM-HLJ株的基因组DNA中扩增出大小为1 011 bp的脂蛋白E编码基因(PlpE),经序列测定显示,其氨基酸序列与A型多杀性巴氏杆菌参考株PlpE序列一致性为95.83%。将PM-HLJ的PlpE基因克隆于表达质粒pET-30a(+)并诱导表达,将表达的重组脂蛋白E纯化后经腹腔免疫小鼠,间接ELISA检测结果显示各免疫组均产生了针对重组脂蛋白E的IgG抗体,免疫保护试验显示,当小鼠免疫剂量为20μg、30μg、40μg和60μg时,保护率分别达到20%、40%、80%和100%。结果表明,牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌重组脂蛋白E具有良好的免疫保护作用。

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖(LPS)含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14d血清抗体达1∶64~1∶128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。

牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ。参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因。选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析。结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%。由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道。

云南猪源A型多杀性巴氏杆菌PMJC-1株的分离鉴定

为探明2022年2月玉溪市江川区某规模猪场大批保育猪发病死亡原因,对采集病料进行了细菌分离,从肺门淋巴结分离得到一株菌落表面光滑、湿润、半透明圆形菌株。分离菌株经生化试剂条鉴定为多杀性巴氏杆菌,分离菌株的16S rRNA序列与NCBI GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌PM8-6株的同一性达到99%以上,将分离菌株命名为PMJC-1株。荚膜分型结果显示该菌株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,毒力基因检测结果显示该菌含有黏附素、超氧化物歧化酶等6种毒力基因。分离菌株药敏试验表明,其仅对利福平、头孢哌酮、阿莫西林、呋喃妥因、头孢噻吩、大观霉素6种药物敏感,对其余18种药物均耐药。动物致病性试验结果显示该菌株对昆明小鼠具有较强致病性,8只实验组昆明小鼠在接种后72 h内发病死亡5只,其余3只发病后耐过康复。本研究结果可为生猪养殖过程中A型多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考。