猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析

[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化,以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性,通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带,表明重组病毒纯化成功,再通过PCR验证RFP基因有目的条带,表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示,与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F 1—F 10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象,表明重组病毒可稳定表达外源基因;测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线,重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株,为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。

鸽Ⅰ型副黏病毒、圆环病毒和疱疹病毒混合感染的诊断

研究旨在确诊广西某肉鸽场中出现神经症状的病鸽并为该场提供相应的防治方案,通过临床诊断、病理解剖、分子生物学检测、细菌分离、病毒分离等方法对广西某肉鸽场病鸽进行诊断。结果显示,剖检可见病鸽肝脾肿大、坏死,花斑肾;分子生物学检测结果显示,鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1)、圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)和疱疹病毒(pigeon herpesvirus,PiHV)为阳性;对病样进行细菌培养,结果未分离到细菌;将病样接种SPF鸡胚进行病毒分离,结果显示,尿囊液血凝效价稳定在8 log2,其血凝性可被新城疫病毒(NDV)阳性血清抑制,但不能被禽流感病毒(AIV)阳性血清抑制。研究表明,最终诊断结果为PPMV-1、PiCV和PiHV混合感染。

mNGS拟诊重症Ⅰ型单纯疱疹病毒肺炎4例诊治并文献复习

目的:探讨免疫功能正常的重症Ⅰ型单纯疱疹病毒(typeⅠherpes simplex virus,HSV-1)肺炎的诊治思路。方法:收集和回顾4例2021年4月至12月入住上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸重症监护室(respiratory intensive care unit,RICU)诊断为重症HSV-1肺炎患者的诊治过程,并复习国内外相关文献。4例患者均为男性,年龄72~89岁。结果:4例患者以发热、咳嗽、咳痰(部分患者有血性痰)、气喘和呼吸困难为主要症状。患者均出现重度Ⅰ型呼吸衰竭,感染指标均上升,同时淋巴细胞计数相对下降,CD3、CD4、CD8绝对计数在治疗后均出现明显上升。呼吸道标本的宏基因组二代测序(metagenomic next generation sequencing,mNGS)中都检测到HSV-1。所有患者采用早期抗病毒、激素抗炎,呼吸支持治疗后,病情均好转,其中3例治愈出院。文献共检索到免疫力低下的HSV-1肺炎26例,免疫功能正常3例。29例患者的临床症状、体征缺乏特异性,经验性给予抗细菌或真菌治疗无效后,多数进一步完善肺泡灌洗液病原学检查,证实HSV-1感染后,积极给予阿昔洛韦抗病毒治疗,部分患者联合激素治疗,3例免疫功能正常者病情均好转,26例免疫力低下者中22例好转,4例死亡。结论:高龄重症HSV-1性肺炎临床表现缺乏特异性,诊断存在一定难度。呼吸道分泌物mNGS检查联合常规实验室检查有助于该病的诊断。早期认识该病,予以抗病毒药物,短程使用糖皮质激素治疗可有效治疗该病。

猫疱疹病毒Ⅰ型荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

研究旨在建立实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type Ⅰ,FHV-1)的方法,用于检测临床上猫的上呼吸道传染病样本。据GenBank已发表的猫疱疹病毒的gE基因序列的保守区域设计并合成一对特异性引物及探针,建立FHV-1的实时荧光定量PCR检测方法,对此方法进行特异性、灵敏度及重复性的验证,并对广东佛山某流浪猫基地猫疱疹病毒的流行情况进行调查,即对该基地的94份临床样品进行检测。结果表明:研究成功建立了FHV-1实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,此方法特异性强,与大多流行的犬猫病毒均未出现交叉反应;敏感性高,最低检出限为10 copies·μL^(-1);重复性好,批内变异系数为0.29%~0.71%,批间变异系数为0.88%~1.38%。应用此方法在94份临床样品中检出28份FHV-1核酸阳性样品。综上所述,研究建立的FHV-1荧光定量聚合酶链式反应方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,为临床上FHV-1的快速检测提供了可行的解决方案。

1例猫杯状病毒与疱疹病毒Ⅰ型混合感染的诊疗

文章介绍了1例猫杯状病毒-猫疱疹病毒Ⅰ型混合感染的诊疗情况。通过猫呼吸道病原体5联荧光核酸检测方法进行诊断,采用抗病毒、提升免疫力、消炎的治疗方案,14天后康复。

猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从32份猫临床样品中检测出FHV-1阳性11份、FCV阳性21份、Bb阳性4份,并经PCR测序验证。本研究初步建立了FHV-1、FCV、Bb多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,具有特异性强、敏感性高的特点,为临床猫上呼吸道疾病病原的分子检测提供参考。

Ⅰ型牛疱疹病毒VP22蛋白原核表达及多克隆抗体制备

为制备Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)VP22蛋白抗体,选用国内分离株BHV-SHJS,在其UL49基因核酸序列第517至747位间设计引物扩增目的片段,构建pET-28a-UL49(172-249 aa)原核表达载体,转化载体至BL21(DE3)感受态细胞;经IPTG诱导表达并纯化VP22(172-249 aa)融合蛋白后;用该融合蛋白作抗原,以皮下注射的方式免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体;经间接ELISA、Western blot及间接免疫荧光(IFA)方法检测其灵敏度和特异性。结果表明,表达的VP22蛋白以包涵体形式存在;ELISA测定结果显示,制备的VP22蛋白抗体效价达到1∶16000;Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能与BHV-SHJS VP22特异性结合,具有良好的反应原性。试验结果为后期BHV-1感染宿主细胞在机制方面的研究和VP22功能的探究奠定了基础。

牛Ⅰ型胶原的性能表征及标准样品研制

以牛Ⅰ型胶原作为研究对象,胶原标准样品研制为目标,对其红外光谱特征、三螺旋结构、热稳定性、氨基酸覆盖率、端肽残留、分子质量等主要性能指标进行分析,将羟脯氨酸含量作为判定依据对产品的均匀性进行分析;利用SDS-PAGE法对其稳定性进行分析;以8家实验室测定的羟脯氨酸含量进行定值和不确定度分析。结果表明,该产品的各项性能指标符合胶原蛋白的质量要求。该牛Ⅰ型胶原产品在95%置信区间内均匀性良好;在4℃放置2周、4周,25℃放置1周、2周,反复冻融1次、3次和5次及在-20℃放置6个月,产品稳定性良好;羟脯氨酸含量的定值结果为11.17%,置信度为95%时扩展不确定度为0.03(k=2)。因此,该牛Ⅰ型胶原可作为国家标准样品用于胶原产品的质量评价。

一例猫疱疹病毒Ⅰ型与猫杯状病毒共感染的诊治

1只2月龄雄性英国短毛猫因出现流涎、舌尖糜烂、食欲不振等症状而就诊,采用猫泛白细胞减少症病毒(FPV)抗原快速诊断试纸以及猫呼吸道病原体核酸5联检测,诊断为猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-Ⅰ)与猫杯状病毒(FCV)共感染。通过消炎、抗病毒、止痛治疗后,患猫于治疗第3 d情况好转,口腔分泌物开始减少,食欲好转,治疗后第10 d,患猫基本恢复正常,精神状态良好,溃疡处基本愈合,恢复正常进食。

表达牛呼吸道合胞体病毒G蛋白基因的重组Ⅰ型牛疱疹病毒的构建与鉴定

为构建表达牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白基因的牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)重组病毒,本研究将人工合成的BRSV全长G蛋白基因编码序列插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建TK基因缺失转移载体。利用磷酸钙-DNA沉淀法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过反向蚀斑筛选,得到重组病毒BHV-1/TK-/G+。PCR检测结果证实G蛋白基因已经插入到了亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组中,间接免疫荧光试验和western blot证实BHV-1/TK-/G+中的G蛋白基因在感染的细胞中获得了表达。本研究为研制BRSV及其他重要牛传染病的BHV-1病毒活载体疫苗奠定了基础。

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。

Ⅰ型牛疱疹病毒潜伏感染机制研究进展

Ⅰ型牛疱疹病毒（BoHV-1）主要引起牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis,IBR）、母牛传染性脓疱性外阴阴道炎（infectious pustular vulvovaginitis,IPV）、公牛传染性脓疱性龟头包皮炎（infectious pustular balanoposthitis,IPB）。病毒形成潜伏感染是病毒的生存策略,尽管机体对病毒感染能形成显著的免疫反应,

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株的MDBK细胞中扩增gD基因,将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析,设计合成3对引物,以获得的克隆质粒为模板,PCR扩增gD胞外域基因,将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T-gDQ、pGEX-4T-gDQB、pGEX-4T-gDHB和pET-gDQ、pET-gDQB、pET-gDHB,利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果pGEX-4T-gDQ、pGEX-4T-gDQB、pGEX-4T-gDHB和pET-gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小,Western blot表明表达产物均有抗原性。

融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗的构建及其免疫应答

用小鼠模型评价融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗和不同免疫策略的免疫应答。用PCR方法扩增牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因,分别克隆到pMD18-T载体并测序验证正确后将其克隆到质粒pcDNA的相应位点获得质粒pcDNA-VP22-P12A3C。然后将BALB/c小鼠分成7组进行免疫。结果表明,DNA疫苗pcDNA-VP22-P12A3C诱导的细胞免疫水平超过了灭活疫苗,DNA疫苗与灭活疫苗联合免疫组体液免疫水平接近灭活疫苗组而细胞免疫水平远高于灭活疫苗组,为进一步研究VP22和P12A3C融合表达的基因工程疫苗奠定了基础。

牛疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及在牛源样本检测中的应用

目的建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)PCR检测方法,用于临床牛样本中BHV-1的检测。方法根据已发表的BHV-1 gB基因保守区域设计合成引物,建立BHV-1 PCR方法,对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价,并用建立的PCR方法检测64份牛临床样本。结果建立的BHV-1 PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为5lg TCID50/mL,对应的DNA模板浓度为5.26×10~2拷贝/μL;BHV-1 DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用建立的方法检测145份牛源组织样本,BHV-1核酸阳性率为15.2%。结论建立的BHV-1PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,适合于临床牛样本BHV-1的感染的检测。

三例猫疱疹病毒Ⅰ型的诊断与治疗

猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus-1,FHV-1)又叫猫鼻支气管炎(Feline Rhinotracheitis),是引起猫呼吸道感染的常见病原,具有较强的传染性。根据患猫的眼鼻分泌物增加、打喷嚏、食欲不振等情况,结合血常规检测和荧光定量PCR检测,诊断出患猫为FHV-1感染。通过使用抗生素、注射干扰素、减少眼鼻分泌物、提高自体免疫力等方法治疗痊愈,本文总结和探讨了此病的快速检测方法和治疗方案,以供大家参考。

Ⅰ型牛疱疹病毒活载体疫苗的构建及研究进展

I型牛疱疹病毒(BHV-1)可引起牛的呼吸道疾病、生殖道损害、流产甚至致死性系统感染,给养牛业造成了严重的经济损失,疫苗接种是防治本病的主要措施。文章介绍了其活载体疫苗的构建原理、研究进展及应用前景方面内容。

牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)免疫逃逸机制研究进展

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)为α疱疹病毒亚科成员,是引起牛多种疾病的重要病原之一。BHV-1面对牛免疫系统的不断进化,产生出多种机制以逃逸宿主的免疫防御,其主要包括诱导外周血单个核细胞凋亡、感染淋巴细胞和抑制淋巴细胞反应、抑制干扰素-β表达和建立潜伏感染等多种免疫逃逸机制。BHV-1的免疫逃逸给治疗和预防BHV-1所导致的相关疾病造成了极大的困难。尤其以潜伏感染最为严重,它能使患病动物终身带毒并能实现病毒的再激活。故主要阐述BHV-1的上述免疫逃逸机制,以期对相关疾病的防制和疫苗创制提供一定的帮助。

牛疱疹病毒Ⅰ型诱导MDBK细胞凋亡的初步研究

【目的】研究牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-Ⅰ)对牛肾细胞(MDBK细胞)的作用,为探讨BHV-Ⅰ诱导细胞凋亡的分子机制奠定基础。【方法】常规方法培养MDBK细胞,于对数生长期感染BHV-Ⅰ,同时设立对照组,于感染后不同时间取样,采用细胞形态观察、细胞活性检测、细胞核形态观察、DNA ladder检测、细胞凋亡率检测和细胞内Caspase-3活性检测等方法,对BHV-Ⅰ感染的MDBK细胞进行凋亡指标检测。【结果】接毒后24h,MDBK细胞即出现明显的细胞病变。活性检测表明,感染BHV-Ⅰ的细胞活性降低,并且呈病毒感染量和感染时间的依赖性。感染细胞出现核固缩,并呈新月形变化。DNA电泳结果和流式细胞术检测结果均表明,感染BHV-Ⅰ的细胞DNA出现规律的片段化,细胞凋亡比例随感染时间延长而增加,细胞内Caspase-3活性逐渐升高。【结论】BHV-Ⅰ能够诱导MDBK细胞凋亡,并且在诱导细胞凋亡过程中有Caspase-3参与。