牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。

新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定

新疆许多规模化牛场存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染,且因病毒基因型具有多样性,给该病的防控、疫苗选择、净化带来了一定的困难,开展新疆地区规模化牛场BVDV基因分型鉴定,对BVDV防控具有重要的指导作用。采集BVDV胶体金抗原检测卡确定为阳性的犊牛抗凝血样品并分离淋巴细胞,在MDBK单层细胞上进行病毒分离,盲传5代,提取培养物RNA,以BVDV5′-UTR、N^_(pro)特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分析。结果显示,获得BL分离株1株,属于BVDV-1m亚型,研究结果丰富了新疆南疆地区规模牛场BVDV分子流行病学数据库。

规模牛场牛病毒性腹泻-黏膜病流行病学调查

[目的]掌握病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)在规模牛场3个品系牛间的感染状况,了解不同品系间BVDV感染是否存在差异。[方法]选择新疆师市范围内的19个规模牛场,分别饲喂中国荷斯坦奶牛(以下简称荷牛),弗莱维赫乳肉兼用牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称弗荷牛),挪威红牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称挪荷牛);共计采集血清样品7 965份,分别使用牛病毒性腹泻(BVD)实时荧光RT-PCR检测和牛病毒性腹泻ELISA方法检测抗原和抗体阳性率。[结果]实时荧光RT-PCR阳性总检出率为1.72%,荷牛阳性检出率为1.73%,弗荷牛阳性检出率为1.35%,挪荷牛阳性检出率为2.05%;场群阳性检出率为68.42%;3个品系的犊牛、青年牛、后备牛、成母牛均检测到BVDV,3个品系牛之间抗原阳性率差异不显著;牛病毒性腹泻ELISA方法检测阳性总检出率为36.69%,荷牛阳性检出率为37.11%,弗荷牛阳性检出率为36.74%,挪荷牛阳性检出率为34.02%,场群抗体阳性率为100%,3个品系牛之间抗体阳性率差异不显著。[结论]师市规模牛场3个品系牛均存在BVDV感染,且不同品系间BVDV感染率差异不显著。

牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用

为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性研究

本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液,2 mL/头。试验结果表明,免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状,也不引起白细胞水平的下降;仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒,在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4~6月龄的犊牛安全性良好。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗在怀孕母牛中垂直传播能力评价

本研究通过对怀孕母牛免疫牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗后检测胎牛组织中是否存在疫苗病毒,以评价该疫苗的垂直传播能力。试验将16头牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原和抗体阴性,怀孕60~90 d的母牛随机分成2组,第1组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。第2组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。母牛免疫后血清抗体转阳,BVDV抗体明显升高。免疫后第56 d剖取免疫牛的胎牛,采集胎牛脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织用病毒分离方法检测牛病毒性腹泻病毒。结果显示,所有怀孕母牛在整个试验期内无任何临床症状,也无流产现象。试验结束时胎牛发育良好,且未在胎牛的脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织中分离到牛病毒性腹泻病毒。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对怀孕母牛和胎牛都是安全的,无垂直传播。

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)对养牛业具有重大经济影响,而快速准确检测对于早期发现牛BVDV感染以便迅速采取针对性预防措施至关重要。常见的BVDV检测方法包括病毒分离鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。本文分别从病原学、血清学和分子生物学检测方面,对多种BVDV检测方法研究进展进行综述,分析每种检测方法的优势和局限性,提出了在实际应用中应根据不同需求选用不同的方法或综合应用多种检测技术的建议,以期为建立更加快速、实用和准确的BVDV检测方法及其应用提供参考。

关于牛病毒性腹泻病毒诊断方法与防治措施探讨

牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒引起的传染性疾病,不仅会导致牛发生腹泻与体温升高,而且还会影响母牛正常繁殖。牛病毒性腹泻在我国普遍流行,对养牛业的发展造成的巨大威胁,同时还会对人类身体健康产生直接或间接影响,给人们的生活带来了一定的安全隐患,因此做好牛病毒性腹泻病毒的诊断与防治至关重要。基于此,本文分析了牛病毒性腹泻的流行病学特点与临床症状,并就牛病毒性腹泻病毒的诊断方法与防治措施进行探究。

羊感染牛病毒性腹泻病毒的诊断和防治措施

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)为可感染牛、羊等家畜的急性传染病,造成家畜低出栏率和高流产率,也造成家畜幼崽高死亡率,对全球畜牧业造成重大影响。目前除疫苗接种外,没有特效药治愈。近年来羊感染牛病毒性腹泻病毒的报道逐渐增多,进一步说明牛病毒性腹泻病毒的传播越发广泛,羊感染该病会出现腹泻等病症,严重的会导致羊只死亡,因此养殖户要对牛病毒性腹泻病的防治引起重视。本篇文章重点概述羊感染BVDV后的临床症状、诊断、实验室鉴定技术,并针对该病提出具体的防治措施,以期在养殖过程中为养殖户防控牛病毒性腹泻病提供帮助。

一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌共感染的诊治

牛病毒性腹泻病毒能引起牛腹泻,而副结核分枝杆菌和弯曲杆菌同样能引起各个年龄段的牛腹泻,甚至流产,当3种病原共感染时,则会加重牛场的经济损失。该文通过一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌共感染病例,从发病情况、实验室检查、药敏试验、防治等方面进行阐述,旨在为防控这3种疫病提供参考。

牛病毒性腹泻病毒的分子生物学特性及发病机制研究进展

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是影响全世界养牛业的重要病原体之一,给畜牧业造成了巨大经济损失。BVDV由2种生物型和多种不同基因亚型毒株组成,这些毒株具有不同的抗原性、细胞病理学和致病性发病机制。尽管世界各国为控制和预防BVDV的发生与流行做出诸多努力,但仍有BVDV感染动物的报道。笔者主要围绕BVDV的分子生物学、发病机制以及宿主对病毒感染的免疫反应尤其是免疫逃避策略、免疫防控等方面进行论述,阐述了BVDV通过劫持宿主免疫系统以确保病毒复制成功的一些免疫逃避策略,以期为遏制BVDV的出现和传播,从而实现净化、控制该病毒提供参考。

牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒四重一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)的方法,根据BVDV 5'UTR基因、BEV 5'UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。

川东北地区腹泻牛群中牛病毒性腹泻病毒的分子流行病学调查及病毒分离鉴定

为了掌握川东北地区腹泻牛群中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染情况和主要流行基因型及亚型,采用RT-PCR方法对采集于川东北地区临床腹泻牛粪便样品进行了病原学检测。根据5'-UTR基因序列进行遗传变异分析和基因分型鉴定,并对RT-PCR阳性样品进行了病毒的分离鉴定。结果显示:97份腹泻样品中BVDV平均阳性感染率为9.28%,达州市的阳性率最高(13.04%)、巴中市的阳性率最低(5.26%)。在5'-UTR基因系统进化树中9份阳性样品均为BVDV-1型,包括BVDV-1a(n=2)和BVDV-1b(n=7),经细胞培养、RT-PCR检测、间接免疫荧光检测共分离鉴定出2株致细胞病变型BVDV。表明川东北地区腹泻牛群中均存在BVDV感染,流行的优势基因亚型为BVDV-1b,丰富了BVDV的分子流行病学资料,为川东北地区BVDV的综合防控提供了理论基础。

内蒙古牛场牛病毒性腹泻病毒调查分析与研究

研究旨在了解内蒙古自治区牛病毒性腹泻病(BVD)的流行规律,对内蒙古自治区的部分荷兰斯坦牛养殖场中BVD的流行情况进行调查,以期为我国BVD的诊断和预防管理提供一定参考。试验于2021—2022年期间,在内蒙古自治区6个荷兰斯坦牛养殖场采集了2 400份牛血清样品,采用荧光定量PCR技术探针法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原,运用牛病毒性腹泻/边界病抗体检测试剂盒cELISA检测BVDV抗体。结果显示,2 400份血清样品中,BVDV抗原阳性数量为460份,占总数的19.17%;其中鄂尔多斯牛场的阳性数最多,占检测样品的28.50%。BVDV抗体阳性数量为334份,占总数的13.92%;其中乌兰察布牛场的阳性数最多,占检测样品的19.50%。研究表明,内蒙古自治区部分荷兰斯坦牛养殖场仍然存在BVDV感染情况,为预防疾病的蔓延和暴发,须采用综合性措施对BVD进行预防和治疗。

小檗胺影响牛病毒性腹泻病毒体外复制的研究

本研究旨在研究天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛病毒性腹泻病毒(BVDV)体外复制。分别配制0、1、5、8、10、15、20μmol/L浓度的BBM,使用MTT法检测BBM对MDBK细胞增殖的影响;并选择抑制作用相对较小浓度的BBM处理牛肾细胞(MDBK)8 h后感染BVDV,使用免疫荧光技术检测BVDV双链RNA(ds RNA)含量,确定最佳用药浓度;分别使用实时荧光定量PCR、Reed-Muench法、倒置显微镜观察来检测BBM对BVDV RNA复制、病毒滴度变化、致细胞病变效应(CPE)的影响。结果显示:10μmol/L BBM对BVDV dsRNA积累具有显著性抑制作用,同时该浓度对MDBK细胞的毒性作用较小;同时采取荧光定量PCR检测和滴度测定,发现在72 h内BVDV感染BBM处理的MDBK细胞与对照相比,5’UTR mRNA水平和子代病毒滴度显著性降低,在BVDV感染24 h和36 h时,子代病毒滴度差异性最大;BVDV感染对照组处理的MBDK细胞会造成严重的CPE现象,而BVDV感染BBM处理的细胞CPE现象较弱。以上结果表明,本研究初步验证BBM显著抑制BVDV在细胞中的复制。

伊犁河谷猪瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染情况调查

目前,我国对生猪重大疫病的防控主要依赖疫苗免疫,且猪群疫病商品化疫苗主要以弱毒苗为主。猪瘟弱毒疫苗是预防猪瘟最常用的理想疫苗,但是,部分生产厂家在猪瘟弱毒苗生产过程中,往往由于使用胎牛血清而出现外源病毒感染的情况,如最常见的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。BVDV感染猪群后,可降低猪瘟疫苗的免疫效价,造成疾病传播的风险。为调查伊犁河谷商品化猪瘟疫苗和胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染的情况,本文对市售的5家厂商生产的不同种类的猪瘟疫苗和6家厂商生产的不同批号的胎牛血清,采用实时荧光定量RT-PCR方法进行BVDV检测。结果显示,猪瘟疫苗中BVDV核酸检测阳性率为18.2%,胎牛血清中BVDV核酸检测阳性率为8.3%,这为伊犁河谷养猪场及科研单位选用安全可靠的猪瘟疫苗与胎牛血清提供了技术支撑。

牛病毒性腹泻病毒的病原学、致病机制及免疫反应的研究进展

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒引起的病毒性疾病,感染后的牛可出现多种不同的临床症状,包括腹泻、流产、免疫抑制等,对全世界牛养殖业造成了严重的经济损失。本文对牛病毒性腹泻病毒的病原学、致病机制和免疫反应的研究进展进行综述,希望为牛病毒性腹泻病病毒疫苗和特效药物的研发提供参考。

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示:该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10^(4)和10^(3)copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%和93.33%,两种病原混合感染的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的IBRV和BVDV双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,为兽医临床快速诊断IBRV和BVDV提供了一种方便、快捷的分子生物学检测手段。

我国牛群中牛病毒性腹泻病毒流行的Meta分析

为全面评估我国牛群中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)病原流行率对该病毒感染的防控,在中国知网(CNKI)、万方、维普、PubMed和ScienceDirect 5个数据库中,检索截止到2021年9月1日发表的关于中国牛群BVDV流行情况的文献,并进行系统评价和Meta分析。共筛选出93篇关于BVDV病原学检测的研究论文纳入Meta分析中。分析结果显示:我国牛群中BVDV病原(抗原和核酸)流行率为9.8%(95%CI:7.8,11.9),其中BVDV抗原流行率为3.1%(95%CI:2.1,4.4),BVDV核酸流行率为19.5%(95%CI:16.0,23.3)。各省间比较发现,吉林流行率最高,为26.3%(95%CI:24.3,28.4),其次是湖北和福建省。进一步开展亚组分析和Meta回归分析的结果显示,品种(牦牛vs奶牛:比值比(odds ratio,OR)=1.37,95%CI:1.05~1.79)、饲养模式(散养vs规模化:OR=1.41,95%CI:1.08~1.85)、诊断方法(RT-PCR vs ELISA:OR=1.64,95%CI:1.38~1.94)、牛体健康状况(有临床症状vs无临床症状:OR=1.42,95%CI:1.20~1.68)、高山高原气候(OR=1.54,95%CI:1.20~1.97)和高海拔(>3 000 m;OR=1.64,95%CI:1.21~2.21)等都是BVDV感染流行的风险因子。以上结果表明,BVDV在我国奶牛、肉牛和牦牛群体中广泛流行,有必要持续监测BVDV感染的流行情况。此外,可根据本研究揭示的风险因子,制定相应的防控方案,防止BVDV在我国牛群中传播。