牛病毒性腹泻病毒与冠状病毒混合感染的PCR诊断

[目的]建立1种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与冠状病毒(BCoV)混合感染的PCR诊断方法。[方法]选择山东省某奶牛场内发生BVDV和BCoV混合感染的98头奶牛作为研究对象,采集其粪便和组织脏器,提取病毒基因组RNA,经反转录后,设计引物,进行PCR检测,分析检测情况及特异性、重复性。[结果]BVDV和BCoV混合感染病例40份(40.82%),其中粪便样本33份(40.27%),组织脏器样本7份(43.75%)。BVDV单一感染病例27份(27.55%),其中粪便样本21份(25.61%),组织脏器样本6份(37.50%)。BCoV单一感染病例32份(32.65%),其中粪便样本28份(34.15%),组织脏器样本4份(25.00%)。[结论]本研究中BVDV和BCoV混合感染的PCR诊断方法准确,具有良好的特异性和重复性,为今后临床正确诊断这两种病毒提供参考,也为后续精准科学防控奠定基础。

牛病毒性腹泻—粘膜病病毒(BVDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻—粘膜病病毒(Bovineviraldiarrhea-mucosaldiseasevirus,BVDV)是引起牛病毒性腹泻—粘膜病的病原,欧美牛体中普遍存在轻性或隐性感染,与猪瘟病毒(HCV)、羊边界病病毒(BDV)具有1种共同抗原,有交叉反应,牛体中的抗体检出率高。本文通过对BVDV的分子生物学的概述,总结BVDV最新的分子生物学研究进展,为进一步预防和控制BVDV提供理论依据。

奶牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV/MDV)病实证分析

采用酶联免疫吸附反应试验(ELISA),对南京某奶牛场的近期有流产史奶牛以及临场表现正常奶牛的血清进行BVDV及相应抗体的检测,再用反转录PCR(RT-PCR)技术对受感染奶牛所感染的BVDV类型进行分析。结果发现,该奶牛场近期有流产史奶牛BVDV重度感染,88个样本中,有84个检出BVDV,感染率高达97.62%,其中单独感染BVDV-Ⅰ(CP)型的比率有29.76%,单独感染BVDV-Ⅱ(NCP)型的比率为25%,同时感染两型的比率为42.86%。根据相对应的抗体检测结果发现有疑似持续感染(PI)牛存在。25个正常血清样本中,有8个样本检出携带有BVDV,且都是BVDV-Ⅰ(CP)型,与近期有流产史奶牛感染BVDV状况有明显差异,但由于正常血清样本数量过少,还需进一步深入研究。

牛病毒性腹泻病毒蛋白的免疫学特性以及相关疫苗研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)众多基因亚型毒株的流行及其宿主谱的扩大干扰着BVDV防控工作。欧洲国家采用全面检测和扑杀BVDV阳性牛的方法达到一定防控效果,但结合我国实际生产情况,使用疫苗防控BVDV仍是最优策略。深入了解病毒感染过程中BVDV蛋白与宿主免疫系统之间的“博弈”,将有助于研究人员在疫苗研发过程中有效规避抗原候选蛋白可能对免疫效果造成的干扰。此外,大力开发低成本、高效力的新型疫苗(如表位肽疫苗和病毒样颗粒疫苗)可以在整合病毒免疫优势抗原表位的基础上加强BVDV相关疫苗的生物安全性,满足用疫苗防控BVDV的要求。鉴于此,本文对BVDV蛋白免疫学功能与特性的研究以及BVDV疫苗开发的现状进行综述,以期为BVDV疫苗研发以及BVDV防控提供一些理论指导。

交叉引物扩增法快速检测牛病毒性腹泻病毒

[目的]牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种可以引起牛腹泻的病原体,在中国分布广泛,给养牛业造成了巨大损失。快速发现和准确鉴定BVDV对后续管理和流行病学调查至关重要。[方法]本研究以5'UTR基因为靶点,应用交叉引物扩增(CPA)与免疫层析试纸相结合的检测方法对BVDV进行检测。[结果]CPA检测限为每次反应640 fg,温度为62℃,反应时间为60 min。未观察到与牛感染的其他病原体发生交叉反应。此外,使用CPA测定法对100份感染BVDV的现场样本进行准确评估。将CPA与常规PCR检测结果进行比较,结果显示,CPA比常规PCR具有更高的检出率。[结论]CPA检测是一种实用、有效的BVDV诊断工具。

牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,经电镜观察可见直径约为50 nm的病毒粒子;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的MDBK细胞内可观察到亮绿色荧光,而对照细胞没有荧光,将分离得到的病毒命名为LN-1株;全基因组扩增序列大小为12269 bp,遗传进化分析发现,LN-1株与XC、SD-15及ZM-95株在同一分支,与XC株核苷酸相似性为96.2%,属于BVDV-1m型。【结论】本研究成功分离出1株1m型BVDV毒株,对后续疫苗研发、流行病学调查及致病机理等方面研究具有重要意义。

2018—2021年中国部分省份牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查

为了解2018—2021年我国部分省份牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的流行情况,本试验采用ELISA和荧光定量PCR方法对来自河北、河南和山东等8个省份的5270份血清和1363份组织样品分别进行BVDV抗体和核酸检测,同时利用微量血清中和试验方法检测BVDV疫苗接种场采集的1449份血清的中和抗体水平。BVDV抗体检测结果显示,在8个省份采集的5270份血清样品中,BVDV抗体总阳性率为78.39%,其中河北抗体阳性率最高(90.03%),甘肃抗体阳性率最低(70.95%);2018—2021年调查区域牛群BVDV抗体阳性率呈逐年上升趋势,年阳性率分别为75.59%、75.44%、86.24%和86.62%。BVDV核酸检测结果显示,采集的1363份组织样品中BVDV核酸总阳性率为7.19%,河北最高(20.71%),山东最低(1.17%);2018—2021年调查区域牛群BVDV核酸年阳性率分别为5.78%、7.96%、3.57%和11.76%。疫苗免疫牛群的抗体持续监测结果显示,在检测的1449份牛血清样品中,BVDV中和抗体效价不低于1∶128的比例达到90.48%;2018—2021年调查牛群BVDV中和抗体效价平均值由1∶938.2上升至1∶1579.3,牛群BVDV中和抗体水平逐渐集中分布在1∶1000~1∶2000,表明疫苗提高了牛群整体的免疫状态。本试验通过调查分析国内主要养牛省份的BVDV流行情况,更新了我国BVDV的流行病学数据,结合疫苗免疫后牛群的抗体监测数据,证实BVDV在国内的流行日趋严重,加强疫病监测和疫苗预防接种将成为我国BVDV防控的关键。

河北省奶牛牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离鉴定

从河北省某规模化奶牛场牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)疑似病例中采集病料,将处理好的病料接种MDBK细胞,盲传9代,得到了不产生细胞病变的病毒。琼脂扩散试验表明本病毒能与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线;细胞培养物用BVD/MD荧光抗体染色检测,可见到荧光着染的特异性细胞,荧光颗粒出现于胞浆中。双抗体夹心ELISA检测病毒抗原结果BVDVOregonC24VP/N为3.141,分离毒P/N为3.012,P/N>2,与BVDVOregonC24V结果一致;电镜观察到圆形、直径为40～60nm,有囊膜,囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。经RT-CR检测,扩增出了唯一的315bp的目的条带,进一步证实为牛病毒性腹泻/粘膜病病毒。

从幼鹿顽固性腹泻病料中检出牛病毒性腹泻——粘膜病病毒

应用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ对长春、前郭、伊通、双阳等地区送检的２８份幼鹿顽固性腹泻病料进行了牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）检测。应用电镜对部分ＥＬＩＳＡ阳性和阴性样品进行负染观察，结果６份阳性样品中均见有ＢＶＤＶ粒子，４份阳性样品未观察到ＢＶＤＶ粒子。结果表明，ＢＶＤＶ可能是引起幼鹿顽固性腹泻的重要病因。

鹿感染牛病毒性腹泻－粘膜病病毒的调查

应用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ对吉林省某地区育成梅花鹿、育成马鹿及马鹿感染牛病毒性腹泻－粘膜病病毒（ＢＶＤ－ＭＤＶ）进行了调查．结果育成梅花鹿的带毒率为３４．１％（２８／８２）；育成马鹿的带毒率为１９，６％（１８／９２）；马鹿带毒率为４４．４％（８／１８）。应用电子显微镜对部分ＥＬＩＳＡ阳性及阴性样品进行负染观察、结果ＥＬＩＳＡ阳性样品中均见有ＢＶＤ－ＭＤＶ粒子．ＥＬＩＳＡ阴性样品中均未观察到ＳＶＤ－ＭＤＶ粒子．本试验结果表明，鹿也可感染ＢＶＤ－ＭＤＶ，其在流行病学中的意义有待于进一步研究。

检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒抗原试剂盒的研制及应用

本研究在双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒（ＢＶＤ－ＭＤＶ）抗原的基础上，研制了检测ＢＶＤＭＤＶ抗原的试剂盒。经试验证明特异、敏感，４℃保存６个月检测结果稳定；与原方法比较，易于保存及运输，使用方便，为商品化推广应用提供了前提。

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株的分离及RT-PCR鉴定

自疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血液中分离得到一株不产生细胞病变的病毒,经双抗体夹心ELISA检测及RT-PCR扩增进一步证实该病毒为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。

抗鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为建立鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)检测方法,本研究制备了抗鹿源BVDV特异性单克隆抗体(MAb)。用纯化的BVDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得2株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株2A3和4B12。通过间接ELISA检测,MAb效价为:上清液及腹水分别为1∶512、1∶640和1∶12800、1∶16000;MAb的亚类鉴定结果表明,2株杂交瘤细胞分泌的抗体亚类均为IgGl亚类;经ELISA测定,2A3和4B12与BVDVC24V株、HCV、BDV、PRV均不发生交叉反应,但与BVDVCCSYD株发生交叉反应;IFA试验结果显示,4B12和2A3与接种BVDVN71株病毒液的细胞反应产生较强的特异荧光;抗原识别位点分析结果表明,2A3和4B12两株MAb所识别的抗原位点相同。这两株MAb的获得为鹿BVDV的检测方法的建立奠定良好的基础。

牛病毒性腹泻的流行病学调查与防控

[目的]了解陕西省榆林市奶牛场牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染情况。[方法]从5家奶牛场采集156份血清样品,采用双抗体夹心ELISA方法进行BVDV抗原检测。[结果]除1家未检测到BVDV,其余4家均存在BVDV感染,BVDV抗原阳性率0~6.38%,平均为4.49%(7/156),成母牛、犊牛、育成牛BVDV抗原阳性率分别为5.66%、4.44%、3.45%。[结论]陕西省榆林市5家奶牛场存在一定的BVDV流行和持续性感染牛,且感染率较高,建议奶牛场采取定期检测、引种检疫、免疫接种等综合防控方法,以有效净化BVDV。

牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒的流行病学调查分析——以辽宁铁岭地区为例

[目的]了解辽宁铁岭地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)的流行病学情况。[方法]对2021年6月至2022年6月辽宁铁岭地区不同奶牛场进行BVDV、BEV的发病情况调查,采集648份病样进行抗原检测。[结果]辽宁铁岭地区不同奶牛场BVDV单一感染率为19.14%,BEV单一感染率为14.97%,BVDV/BEV混合感染率为8.64%,其中不同年龄牛群均存在不同程度的BVDV和BEV混合感染,犊牛混和感染率最低,为4.49%(4/89);育成牛混和感染率为6.35%(12/189);青年牛混和感染率最高,为13.01%(19/146);成母牛混和感染率为9.38%(21/224)。[结论]本研究揭示出辽宁铁岭牛群感染BVDV、BEV的流行病学本底,为进一步防控BVDV与BEV感染提供了可靠的流行病学理论依据。建议对于饲养密度高、规模较大的奶牛场应当定期进行全面的流行病学调查,掌握BVDV、BEV的流行规律。

宿主蛋白DHCR24调控胆固醇合成促进牛病毒性腹泻病毒复制的重要机制发现

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)属于黄病毒科、瘟病毒属成员,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。临床上BVDV主要引起牛病毒性腹泻-黏膜病,临床症状以高热、腹泻、消化道黏膜发炎、糜烂和坏死为主要特征,还可引起呼吸道感染、持续性感染以及免疫抑制。目前,BVDV呈世界性流行,各年龄的牛均可感染,BVDV还可感染绵羊、骆驼、猪等动物。疫苗接种仍是预防BVDV感染的主要措施,但由于BVDV致病机制复杂,常导致免疫失败,且无有效治疗药物。因此,深入探究BVDV的感染与致病机制对该病的防治具有重要意义。

我国牛病毒性腹泻—粘膜病的流行及防制状况

自80年李佑民首次报道牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)在我国存在以来,许多学者对牛病毒性腹泻-粘膜病在我国的流行状况进行了调查,目前该病在我国易感动物中的感染日益严重。国外以检出并淘汰持续感染牛和疫苗接种预防本病,国内对本病尚无有效的防制措施。

狂犬病毒、伪狂犬病毒、马瘟病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒和传染性牛鼻气管炎病毒的保存期试验

进行了狂犬病毒 (巴黎株固定毒 )、伪狂犬病毒 (闽 A株 ,苏联株 )、马瘟病毒 (I,II,III,IV,V,VII型 )、牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 (Oregon C2 4 V株 ,NADL株 )和传染性牛鼻气管炎病毒(NU/6 7株 )的保存期试验。试验结果证明 ,在 - 70℃以下温度保存 ,狂犬病毒巴黎株固定毒保存 1 0年以上 ,伪狂犬病毒闽 A株保存 1 1年以上 ,伪狂犬病毒苏联株保存保存 1 7年 ,马瘟病毒 I、II、III、IV、V和 VII型病毒保存 1 2年以上 ,牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 NADL株和 Oregon C2 4 V株保存1 6年以上 ,传染性牛鼻气管炎病毒 NU/6 7株保存 1