牛病毒性腹泻—粘膜病病毒(BVDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻—粘膜病病毒(Bovineviraldiarrhea-mucosaldiseasevirus,BVDV)是引起牛病毒性腹泻—粘膜病的病原,欧美牛体中普遍存在轻性或隐性感染,与猪瘟病毒(HCV)、羊边界病病毒(BDV)具有1种共同抗原,有交叉反应,牛体中的抗体检出率高。本文通过对BVDV的分子生物学的概述,总结BVDV最新的分子生物学研究进展,为进一步预防和控制BVDV提供理论依据。

奶牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV/MDV)病实证分析

采用酶联免疫吸附反应试验(ELISA),对南京某奶牛场的近期有流产史奶牛以及临场表现正常奶牛的血清进行BVDV及相应抗体的检测,再用反转录PCR(RT-PCR)技术对受感染奶牛所感染的BVDV类型进行分析。结果发现,该奶牛场近期有流产史奶牛BVDV重度感染,88个样本中,有84个检出BVDV,感染率高达97.62%,其中单独感染BVDV-Ⅰ(CP)型的比率有29.76%,单独感染BVDV-Ⅱ(NCP)型的比率为25%,同时感染两型的比率为42.86%。根据相对应的抗体检测结果发现有疑似持续感染(PI)牛存在。25个正常血清样本中,有8个样本检出携带有BVDV,且都是BVDV-Ⅰ(CP)型,与近期有流产史奶牛感染BVDV状况有明显差异,但由于正常血清样本数量过少,还需进一步深入研究。

山东地区1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解并掌握山东地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)流行毒株的生物学特性和遗传变异情况,为BVDV防控提供理论依据和技术支持。【方法】采集养牛场疑似BVDV感染样品制备组织上清液,利用RT-PCR方法进行病原鉴定,接种MDBK细胞进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察对分离毒株进行鉴定,对分离毒株全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并采用Lasergene等软件分别对全基因组序列、N^(pro)和E2基因进行比对和遗传演化分析。【结果】病料样品BVDV特异性引物RT-PCR扩增得到大小约504 bp的目的条带,与预期大小一致。IFA结果显示特异性绿色荧光;电镜下可见直径约50 nm的病毒粒子,表明分离到1株非致细胞病变型BVDV毒株,命名为SDNF9株。分离株基因组全长为12232 nt,与BVDV参考毒株的全基因组核苷酸相似性为79.1%~93.8%,其中,与中国分离毒株22AH-1和澳大利亚毒株Bega-like的相似性最高,为93.8%;N^(pro)和E2蛋白氨基酸存在多个位点变异;SDNF9分离毒株与BVDV2型毒株和BVDV3型毒株处于遗传演化的不同分支,而与BVDV 1型毒株处于同一分支,属于BVDV 1c基因型。【结论】本研究成功分离到1株BVDV 1c流行毒株,并进行基因组和遗传演化分析,与中国分离毒株22AH-1亲缘关系最近,为山东地区牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供数据和材料支持。

1株进口胎牛血清源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及小鼠致病性分析

【目的】对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)进行分离鉴定和遗传进化分析。【方法】通过RT-PCR方法检测到实验室购买的某进口胎牛血清中存在BVDV核酸污染,将污染血清接种MDBK细胞,传代培养至第7代,对每一代细胞的培养物进行BVDV 5′-UTR扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T载体并测序,对测序结果进行遗传进化分析;利用间接免疫荧光试验(IFA)进行分离株抗原检测和病毒滴度测定;将分离株接种BALB/c小鼠,采集眼眶血进行血常规检测和RT-PCR检测。【结果】该病毒分离株在培养MDBK细胞时未能引起细胞病变效应,细胞培养物RT-PCR扩增为阳性;基于5′-UTR序列的相似性分析表明,该分离株与BVDV UDEC-COY7-17(OL860952.1)毒株5′-UTR序列相似性为99.6%,同属BVDV-1e亚型;IFA检测到感染分离株的MDBK细胞细胞质中出现特异性绿色荧光信号,而对照组无信号;半数培养感染剂量(50%tissue culture infectivedose,TCID 50)为10-4.7/0.1 mL;接种BALB/c小鼠后第7天血常规检测其血液中白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)数量极显著低于对照组(P<0.01)。提取血液总RNA进行5′-UTR RT-PCR检测,检测结果为阳性,扩增产物大小为298 bp,与预期相符。【结论】本研究在进口胎牛血清中分离得到1株非致细胞病变型BVDV-1e亚型毒株,证明进口胎牛血清中存在BVDV抗原污染,为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料。

河北省奶牛牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离鉴定

从河北省某规模化奶牛场牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)疑似病例中采集病料,将处理好的病料接种MDBK细胞,盲传9代,得到了不产生细胞病变的病毒。琼脂扩散试验表明本病毒能与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线;细胞培养物用BVD/MD荧光抗体染色检测,可见到荧光着染的特异性细胞,荧光颗粒出现于胞浆中。双抗体夹心ELISA检测病毒抗原结果BVDVOregonC24VP/N为3.141,分离毒P/N为3.012,P/N>2,与BVDVOregonC24V结果一致;电镜观察到圆形、直径为40～60nm,有囊膜,囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。经RT-CR检测,扩增出了唯一的315bp的目的条带,进一步证实为牛病毒性腹泻/粘膜病病毒。

从幼鹿顽固性腹泻病料中检出牛病毒性腹泻——粘膜病病毒

应用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ对长春、前郭、伊通、双阳等地区送检的２８份幼鹿顽固性腹泻病料进行了牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）检测。应用电镜对部分ＥＬＩＳＡ阳性和阴性样品进行负染观察，结果６份阳性样品中均见有ＢＶＤＶ粒子，４份阳性样品未观察到ＢＶＤＶ粒子。结果表明，ＢＶＤＶ可能是引起幼鹿顽固性腹泻的重要病因。

鹿感染牛病毒性腹泻－粘膜病病毒的调查

应用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ对吉林省某地区育成梅花鹿、育成马鹿及马鹿感染牛病毒性腹泻－粘膜病病毒（ＢＶＤ－ＭＤＶ）进行了调查．结果育成梅花鹿的带毒率为３４．１％（２８／８２）；育成马鹿的带毒率为１９，６％（１８／９２）；马鹿带毒率为４４．４％（８／１８）。应用电子显微镜对部分ＥＬＩＳＡ阳性及阴性样品进行负染观察、结果ＥＬＩＳＡ阳性样品中均见有ＢＶＤ－ＭＤＶ粒子．ＥＬＩＳＡ阴性样品中均未观察到ＳＶＤ－ＭＤＶ粒子．本试验结果表明，鹿也可感染ＢＶＤ－ＭＤＶ，其在流行病学中的意义有待于进一步研究。

检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒抗原试剂盒的研制及应用

本研究在双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒（ＢＶＤ－ＭＤＶ）抗原的基础上，研制了检测ＢＶＤＭＤＶ抗原的试剂盒。经试验证明特异、敏感，４℃保存６个月检测结果稳定；与原方法比较，易于保存及运输，使用方便，为商品化推广应用提供了前提。

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株的分离及RT-PCR鉴定

自疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血液中分离得到一株不产生细胞病变的病毒,经双抗体夹心ELISA检测及RT-PCR扩增进一步证实该病毒为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。

抗鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为建立鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)检测方法,本研究制备了抗鹿源BVDV特异性单克隆抗体(MAb)。用纯化的BVDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得2株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株2A3和4B12。通过间接ELISA检测,MAb效价为:上清液及腹水分别为1∶512、1∶640和1∶12800、1∶16000;MAb的亚类鉴定结果表明,2株杂交瘤细胞分泌的抗体亚类均为IgGl亚类;经ELISA测定,2A3和4B12与BVDVC24V株、HCV、BDV、PRV均不发生交叉反应,但与BVDVCCSYD株发生交叉反应;IFA试验结果显示,4B12和2A3与接种BVDVN71株病毒液的细胞反应产生较强的特异荧光;抗原识别位点分析结果表明,2A3和4B12两株MAb所识别的抗原位点相同。这两株MAb的获得为鹿BVDV的检测方法的建立奠定良好的基础。

牛病毒性腹泻病毒与冠状病毒混合感染的PCR诊断

[目的]建立1种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与冠状病毒(BCoV)混合感染的PCR诊断方法。[方法]选择山东省某奶牛场内发生BVDV和BCoV混合感染的98头奶牛作为研究对象,采集其粪便和组织脏器,提取病毒基因组RNA,经反转录后,设计引物,进行PCR检测,分析检测情况及特异性、重复性。[结果]BVDV和BCoV混合感染病例40份(40.82%),其中粪便样本33份(40.27%),组织脏器样本7份(43.75%)。BVDV单一感染病例27份(27.55%),其中粪便样本21份(25.61%),组织脏器样本6份(37.50%)。BCoV单一感染病例32份(32.65%),其中粪便样本28份(34.15%),组织脏器样本4份(25.00%)。[结论]本研究中BVDV和BCoV混合感染的PCR诊断方法准确,具有良好的特异性和重复性,为今后临床正确诊断这两种病毒提供参考,也为后续精准科学防控奠定基础。

我国牛病毒性腹泻—粘膜病的流行及防制状况

自80年李佑民首次报道牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)在我国存在以来,许多学者对牛病毒性腹泻-粘膜病在我国的流行状况进行了调查,目前该病在我国易感动物中的感染日益严重。国外以检出并淘汰持续感染牛和疫苗接种预防本病,国内对本病尚无有效的防制措施。

狂犬病毒、伪狂犬病毒、马瘟病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒和传染性牛鼻气管炎病毒的保存期试验

进行了狂犬病毒 (巴黎株固定毒 )、伪狂犬病毒 (闽 A株 ,苏联株 )、马瘟病毒 (I,II,III,IV,V,VII型 )、牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 (Oregon C2 4 V株 ,NADL株 )和传染性牛鼻气管炎病毒(NU/6 7株 )的保存期试验。试验结果证明 ,在 - 70℃以下温度保存 ,狂犬病毒巴黎株固定毒保存 1 0年以上 ,伪狂犬病毒闽 A株保存 1 1年以上 ,伪狂犬病毒苏联株保存保存 1 7年 ,马瘟病毒 I、II、III、IV、V和 VII型病毒保存 1 2年以上 ,牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 NADL株和 Oregon C2 4 V株保存1 6年以上 ,传染性牛鼻气管炎病毒 NU/6 7株保存 1

猪白细胞干扰素在细胞培养物中干扰牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)病毒的试验

对猪白细胞干扰素在细胞培养物中干扰牛病毒性腹泻 /粘膜病 (BVD/MD)病毒的作用进行了试验。猪白细胞干扰素在 50 0 u/ml以上浓度可完全抑制牛病毒性腹泻 /粘膜病 (BVD/MD)病毒所产生的细胞病变 ,在 2 50 u/ml浓度可部分抑制病毒所产生的细胞病变 ,在 2 50 u/ml以下浓度不能抑制病毒所产生的细胞病变 ,但可使细胞产生细胞病变的时间延长 ,病变程度减轻。本试验证实干扰素在猪和牛之间存在交叉活性。

牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法

牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)为一类黄病毒科、瘟病毒属的单股正链RNA病毒。该病毒在血清学上与猪瘟病毒(CSFV)及羊边界病病毒(BDV)存在交叉反应。此类病毒具有突破宿主特异性交叉感染的能力,不仅感染牛,还可感染其他动物。BVDV的存在对养殖生产造成很大危害。牛血清制备生物制品可能存在BVDV感染和潜在感染的风险。基于此,本文分析了牛病毒性腹泻/黏膜病病毒荧光定量PCR检测方法,以期为相关人员提供参考。

牛病毒性腹泻——粘膜病病毒感染引起的小脑形成不全症

2005年11月、12月,黑龙江省牡丹江市兴隆镇一奶牛饲养户中的2例犊牛发生小脑形成不全症。这2例虽然是正常分娩,却呈现了运动失调及明显的小脑形成不全,吸吮初乳后所保持的病毒性腹泻-粘膜病（BVD-MD）病毒中和抗体滴度比母牛高。另外,确认了与小脑形成不全犊牛同时分娩,而临床症状正常的1头犊牛的胎盘感染。综上所述,2例犊牛小脑形成不全症是病毒性腹泻-粘膜病病毒的胎盘感染所引起的。

苦马豆素抗牛病毒性腹泻病毒的研究

【目的】疯草是中国西部影响草地生态和畜牧业健康发展的毒草之一。主要有豆科棘豆属和黄芪属有毒植物等,在冬季牧草严重缺乏的时节,牛羊等牲畜被迫采食后可引起中毒和生产性能下降,甚至死亡,每年给我国草地生态和畜牧业造成的直接经济损失达几十亿元,是危害最严重的毒草。目前,我国西部天然草地动物因疯草中毒死亡所造成的经济损失仍持续剧增。苦马豆素被认为是引起动物疯草中毒的主要毒性成分。由于疯草分布广泛,资源丰富,如何改善草地生态,合理开发利用疯草成为研究的课题和方向。近几十年来,随着对疯草研究的深入和扩展,人们发现苦马豆素不仅具有良好的抗肿瘤效果,还可作为免疫调节剂、抗HIV及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等药物使用。目前,国内在对苦马豆素抗肿瘤、调节机体免疫方面研究较热,但是,对苦马豆素在抗病毒活性、作用机理方面的研究尚无相关报道。为了探讨茎直黄芪中生物碱苦马豆素(swainsonine,SW)抗牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗BVDV的药物筛选提供参考依据。【方法】利用细胞培养技术,采用CPE观察法和MTT比色法相结合的方法测定不同浓度SW对牛肾原代细胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用,确定药物的安全浓度和TD50,并分别采用先加药后感染病毒、先感染病毒后加药、药毒作用2 h后加入、感染病毒同时给药后再加药四种作用方式,检测不同浓度SW对BVDV入侵的阻断作用、复制的抑制作用、直接杀伤作用和综合作用,并计算不同作用方式下的治疗指数。【结果】结果显示:SW浓度小于0.256μg·mL-1范围内对MBDK细胞无毒性作用,在大于0.512μg·mL-1浓度下MBDK细胞表现出一定程度的病变,TD50为2.512μg·mL-1,按Reed-Muench氏法计算BVDV TCID50为10-4.7/0.1mL;在体外随苦马豆素质量浓度的增加,其抗BVDV作用具有很好的量效关系,且与作用方式有关,比较四种作用方式下的治疗指数1.05、2.47、2.08和3.21,说明SW对BVDV的综合作用(65.29%,P<0.01)和复制(65.05%,P<0.01)的抑制作用较好,亦有一定的直接杀伤作用,但对其入侵的阻断作用不佳。【结论】SW在体外有良好抗BVDV活性作用,并推测苦马豆素(SW)抗病毒的主要效应可能是SW能进入细胞内抑制BVDV的复制增殖以及直接灭活游离BVDV而发挥作用。