牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)-ELISA抗体检测试剂盒的制备

为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试剂盒的准确性、灵敏性和稳定性。结果显示,抗原包被浓度为4μg/mL,1%酪蛋白溶液37℃封闭45 min,被检血清以1∶400稀释孵育30 min,兔抗牛HRP标记二抗以1∶20000稀释孵育30 min,TMB底物反应5 min时,ELISA的反应背景下降,区分度最好。优化后方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均在10%以内,表明该试剂盒具有较好的稳定性;灵敏性试验结果显示,当阳性血清稀释度达到1∶6400时仍可以检测为阳性,说明该试剂盒灵敏度较高;该试剂盒与美国爱德士生物科技公司(IDEXX)BVDV总抗体检测试剂盒共同检测466份临床血清样品,两者总符合率为89.1%;保存期试验结果显示,第4个月时该试剂盒仍能检测到阳性血清,说明稳定性较好。综上表明,本试验利用E^(rns)蛋白建立的BVDV间接ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高且重复性好,可为BVDV抗体检测和流行性调查提供新的方法。

河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85%(6/323)、BCoV阳性检出率14.24%(46/323)、BRV阳性检出率57.89%(187/323)、BoAstV阳性检出率0.31%(1/323)、BoNeV阳性检出率10.84%(35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48%(8/323)、BToV阳性检出率4.64%(15/323)、BKoV阳性检出率11.76%(38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。

牛病毒性腹泻诊断与防治研究进展

近年来,牛病毒性腹泻在世界范围内广泛流行,给养牛业造成了严重的经济损失。该病严重损害牛群的免疫机能和繁殖机能,传播速度快,死亡率高。本文主要从诊断方法、防治措施等方面对该病进行综述,以期为牛病毒性腹泻的防治提供参考。

新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定

新疆许多规模化牛场存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染,且因病毒基因型具有多样性,给该病的防控、疫苗选择、净化带来了一定的困难,开展新疆地区规模化牛场BVDV基因分型鉴定,对BVDV防控具有重要的指导作用。采集BVDV胶体金抗原检测卡确定为阳性的犊牛抗凝血样品并分离淋巴细胞,在MDBK单层细胞上进行病毒分离,盲传5代,提取培养物RNA,以BVDV5′-UTR、N^_(pro)特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分析。结果显示,获得BL分离株1株,属于BVDV-1m亚型,研究结果丰富了新疆南疆地区规模牛场BVDV分子流行病学数据库。

山东地区1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解并掌握山东地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)流行毒株的生物学特性和遗传变异情况,为BVDV防控提供理论依据和技术支持。【方法】采集养牛场疑似BVDV感染样品制备组织上清液,利用RT-PCR方法进行病原鉴定,接种MDBK细胞进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察对分离毒株进行鉴定,对分离毒株全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并采用Lasergene等软件分别对全基因组序列、N^(pro)和E2基因进行比对和遗传演化分析。【结果】病料样品BVDV特异性引物RT-PCR扩增得到大小约504 bp的目的条带,与预期大小一致。IFA结果显示特异性绿色荧光;电镜下可见直径约50 nm的病毒粒子,表明分离到1株非致细胞病变型BVDV毒株,命名为SDNF9株。分离株基因组全长为12232 nt,与BVDV参考毒株的全基因组核苷酸相似性为79.1%~93.8%,其中,与中国分离毒株22AH-1和澳大利亚毒株Bega-like的相似性最高,为93.8%;N^(pro)和E2蛋白氨基酸存在多个位点变异;SDNF9分离毒株与BVDV2型毒株和BVDV3型毒株处于遗传演化的不同分支,而与BVDV 1型毒株处于同一分支,属于BVDV 1c基因型。【结论】本研究成功分离到1株BVDV 1c流行毒株,并进行基因组和遗传演化分析,与中国分离毒株22AH-1亲缘关系最近,为山东地区牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供数据和材料支持。

不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。

宿主蛋白Rab11a对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)后,对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株,设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体,采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白表达情况;使用实时荧光定量qPCR、免疫荧光染色试验、Reed-Muench法等技术检测BVDV感染Rab11a KO细胞后病毒RNA水平、双链RNA(dsRNA)积累水平、病毒滴度及致细胞病变(CPE)情况等。Western blot检测结果显示,成功构建出Rab11a基因敲除的细胞Rab11a KO;Rab11a基因敲除显著抑制BVDV 5'UTR mRNA和dsRNA水平的积累,感染36 h后,Scramble细胞明显有大量细胞病变,出现皱缩、碎裂、形成空泡后脱落等现象,Rab11a KO细胞的CPE现象明显低于Scramble细胞;在BVDV感染细胞12 h后,与Scramble细胞相比,Rab11a KO细胞的病毒滴度显著性降低,结果证明了敲除MDBK细胞的Rab11a基因对BVDV在胞内复制起到抑制作用。本研究结果为了解宿主蛋白Rab11a与BVDV的相互作用,以及Rab11a对病毒的复制增殖的作用提供了新的科学依据。

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p20的原核表达

牛病毒性腹泻是由黄病毒科、瘟病毒属中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染牛引起的一种传染病,是一种全球性牛传染病。为了在原核表达系统表达BVDV非结构蛋白p20,并分离纯化蛋白进行晶体学研究。首先对BVDV-1 p20蛋白基因进行密码子优化,合成后克隆到pET30表达载体上。测序鉴定成功的pET30-p20表达质粒转化大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导获得的p20蛋白经过Ni柱、分子筛纯化。最终,经过多重缓冲溶液的筛选,p20蛋白可以稳定存在于含有5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5%甘油、150 mmol/L氯化钠(pH8.0)的Tris-HCl缓冲液中。高纯度均一性的p20蛋白获得,为后续p20晶体学研究以及单克隆抗体的制备提供原核表达纯化方案。

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)对养牛业具有重大经济影响,而快速准确检测对于早期发现牛BVDV感染以便迅速采取针对性预防措施至关重要。常见的BVDV检测方法包括病毒分离鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。本文分别从病原学、血清学和分子生物学检测方面,对多种BVDV检测方法研究进展进行综述,分析每种检测方法的优势和局限性,提出了在实际应用中应根据不同需求选用不同的方法或综合应用多种检测技术的建议,以期为建立更加快速、实用和准确的BVDV检测方法及其应用提供参考。

规模牛场牛病毒性腹泻-黏膜病流行病学调查

[目的]掌握病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)在规模牛场3个品系牛间的感染状况,了解不同品系间BVDV感染是否存在差异。[方法]选择新疆师市范围内的19个规模牛场,分别饲喂中国荷斯坦奶牛(以下简称荷牛),弗莱维赫乳肉兼用牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称弗荷牛),挪威红牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称挪荷牛);共计采集血清样品7 965份,分别使用牛病毒性腹泻(BVD)实时荧光RT-PCR检测和牛病毒性腹泻ELISA方法检测抗原和抗体阳性率。[结果]实时荧光RT-PCR阳性总检出率为1.72%,荷牛阳性检出率为1.73%,弗荷牛阳性检出率为1.35%,挪荷牛阳性检出率为2.05%;场群阳性检出率为68.42%;3个品系的犊牛、青年牛、后备牛、成母牛均检测到BVDV,3个品系牛之间抗原阳性率差异不显著;牛病毒性腹泻ELISA方法检测阳性总检出率为36.69%,荷牛阳性检出率为37.11%,弗荷牛阳性检出率为36.74%,挪荷牛阳性检出率为34.02%,场群抗体阳性率为100%,3个品系牛之间抗体阳性率差异不显著。[结论]师市规模牛场3个品系牛均存在BVDV感染,且不同品系间BVDV感染率差异不显著。

1株进口胎牛血清源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及小鼠致病性分析

【目的】对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)进行分离鉴定和遗传进化分析。【方法】通过RT-PCR方法检测到实验室购买的某进口胎牛血清中存在BVDV核酸污染,将污染血清接种MDBK细胞,传代培养至第7代,对每一代细胞的培养物进行BVDV 5′-UTR扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T载体并测序,对测序结果进行遗传进化分析;利用间接免疫荧光试验(IFA)进行分离株抗原检测和病毒滴度测定;将分离株接种BALB/c小鼠,采集眼眶血进行血常规检测和RT-PCR检测。【结果】该病毒分离株在培养MDBK细胞时未能引起细胞病变效应,细胞培养物RT-PCR扩增为阳性;基于5′-UTR序列的相似性分析表明,该分离株与BVDV UDEC-COY7-17(OL860952.1)毒株5′-UTR序列相似性为99.6%,同属BVDV-1e亚型;IFA检测到感染分离株的MDBK细胞细胞质中出现特异性绿色荧光信号,而对照组无信号;半数培养感染剂量(50%tissue culture infectivedose,TCID 50)为10-4.7/0.1 mL;接种BALB/c小鼠后第7天血常规检测其血液中白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)数量极显著低于对照组(P<0.01)。提取血液总RNA进行5′-UTR RT-PCR检测,检测结果为阳性,扩增产物大小为298 bp,与预期相符。【结论】本研究在进口胎牛血清中分离得到1株非致细胞病变型BVDV-1e亚型毒株,证明进口胎牛血清中存在BVDV抗原污染,为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料。

牛病毒性腹泻净化效果研究

为了解吉林省某规模牛场BVDV的流行情况,并制定净化方案,应用BVDV ELISA试剂盒对2022年3月—2023年10月采集吉林省某规模牛场的血液和粪便样本进行病原学调查。结果表明:该牛场全群BVDV抗体、抗原阳性率分别为2.72%、0.85%,抗原阳性5头(其中成年牛1头,后备牛1头,犊牛3头),抗体阳性16头(其中成年牛5头,后备牛5头,犊牛6头)。对检测为BVDV阳性的牛直接淘汰,并通过3次复检,筛选出BVDV持续性感染牛,对其进行淘汰,并对检测阴性牛免疫。经过长达1年的监测及淘汰,该规模牛场BVDV病原学检出率为0,取得了良好净化效果。

牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的截短表达及多克隆抗体制备

本研究旨在克隆牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的非结构蛋白NS5B截短基因,采用原核表达系统表达获得截短蛋白,并进一步制备其多克隆抗体。构建的原核表达质粒pET-28a-NS5B转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导后,发现NS5B蛋白以包涵体为主。纯化蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有良好的反应性,能够特异性识别真核表达的NS5B蛋白。本研究中NS5B蛋白的截短表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NS5B蛋白的生物学功能,以及建立BVDV鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性研究

本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液,2 mL/头。试验结果表明,免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状,也不引起白细胞水平的下降;仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒,在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4~6月龄的犊牛安全性良好。

牛病毒性腹泻的发病趋势及综合防控

近年来,随着我国规模化、集约化养殖模式的发展壮大,牛病毒性腹泻在我国牛群养殖过程中发病率逐年攀升。目前,已经在我国大部分地区广泛流行,严重阻碍了养牛业的健康发展。为提高广大从业人员对这一疾病的认识,掌握该病科学的防控策略,降低牛病毒性腹泻对我国养牛业的危害,本文对牛病毒性腹泻的流行特点、临床症状、诊断方法及综合防治措施进行了具体分析阐述,以期能够为该病的防控和净化提供参考。

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒感染牛引起牛发生呼吸道疾病、免疫抑制及生殖障碍等特征的急性、高度接触性传染病。由于牛感染该病后与其他引起牛腹泻的病症类似,需要根据不同的情况选择相应的检测方法,及时切断BVDV牛群间的相互传播,减少因感染该病而造成的经济损失。因此,建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要。本文综述了牛病毒性腹泻病原及用于检测该病的检测方法,如病毒分离鉴定、RT-PCR、微滴式数字RT-PCR(dd-PCR)、纳米PCR、二温式PCR等检测技术,以期为牛病毒性腹泻的科学检测、诊断及防控提供理论基础。

平凉地区肉牛腹泻源病毒性腹泻病毒的分离鉴定

为分离与鉴定平凉地区肉牛腹泻源病毒,采集5份甘肃省平凉地区某大型规模化肉牛养殖场内疑似感染BVDV的肉牛粪便作为研究病料,经MDBK细胞接种分离病毒、病毒含量测定、琼脂扩散试验、RT-PCR、动物回归试验对病毒进行分离与鉴定。结果可见,共分离获得2株BVDV,TCID_(50)值分别为10^(-5.88)/0.1 mL、10^(-5.61)/0.1 mL;这2株病毒经RT-PCR可特异性扩增出1条大小为804 bp的目标电泳条带,与BVDV Oregon C24标准阳性血清的琼脂扩散试验能够产生明显的沉淀线,且与BVDV标准抗原形成的沉淀线相连;接种分离获得的2株病毒至动物体内,可表现出典型的BCVD临床症状。该研究成功从平凉地区肉牛养殖场内分离鉴定出2株BVDV毒株,且毒株的致病性较强,与标准毒株的抗原性相同,可导致肉牛产生典型临床症状。

肉牛病毒性腹泻临床症状剖析与防治措施

通过研究分析发现,一旦肉牛出现了病毒性腹泻问题,会影响其自身的生命安全,并出现快速传染问题,影响整个肉牛养殖场的经济效益。同时在出现病毒性腹泻以后如果没有及时采取相应的治疗措施,会导致患病牛的死亡率增加,必须对肉牛养殖场的病毒性腹泻问题进行全面的分析,及时采取相应的隔离措施。通过对病毒性腹泻问题进行深入分析,了解其流行病学以及临床症状,进而在后期防治的过程中能够做到准确用药,加大其防治的效果,避免造成较大的损失。

牛病毒性腹泻的诊断方法及防控

牛病毒性腹泻是牛较为高发的一种传染病,也被称为牛病毒性腹泻-黏膜病。该病主要以白细胞减少、黏膜糜烂、腹泻、发烧等为主要临床表现,不仅死亡率较高,而且会对病牛生长性能造成严重影响。妊娠母牛在感染牛病毒性腹泻后还会出现产畸形胎、滑胎、流产现象。