牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。

一株白牦牛源牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与序列分析

【目的】本研究旨在对来源于白牦牛的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) GSTZ株的E0基因进行分析,并利用E0基因对GSTZ进行基因分型。【方法】通过提取牛病毒性腹泻病毒(BVDV) RNA,使用RT-PCR技术扩增BVDV E0基因,将其插入到pET-28a中,构建pET-28a-E0原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆,鉴定及测序。IPTG诱导后使用BVDV阳性血清作一抗,经western blot鉴定。根据E0基因的序列进行同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树。利用DNAstar预测E0蛋白的抗原表位。【结果】本研究表达的E0蛋白大小与预期结果相符且该蛋白具有良好的抗原性。通过对E0基因序列的同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树,说明牛病毒性腹泻病毒GSTZ株基因型可能属于牛病毒性腹泻病毒-1a亚型,也可能是其他基因亚型发生较大突变产生变异。通过预测E0蛋白B细胞的抗原表位主要位于:7-12、22-26、62-63、94-97、101-105、115-119、127-128、138-140、185-187、215-219位氨基酸残基; T细胞潜在优势抗原区域主要位于:10-14、19-31、36-43、52-58、77-86、96-98、137-140、148-150、167-191、209-211位氨基酸残基。【结论】E0蛋白具有良好的抗原性,通过对抗原表位预测以及对GSTZ进行基因分型,为后续基因工程疫苗和BVDV检测试剂盒的开发提供了理论依据。

牛病毒性腹泻病毒E0基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)C24V株接种MDBK细胞,提取病毒RNA,扩增出BVDV-E0基因,将所得片段与pET-28a表达载体连接,转化至BL-21大肠杆菌中,筛选阳性克隆,鉴定后证明pET-28a-E0原核表达载体构建成功。经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定,鉴定结果表明,目的蛋白在大肠杆菌中得以表达。

共表达牛病毒性腹泻病毒E0基因和牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的重组质粒DNA构建及其对小鼠的免疫效应

本研究计划构建能同时表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)优势抗原基因的重组质粒并研究其免疫效果,旨在为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供参考。采用PCR扩增目的基因E0及gD并将其依次连接至真核表达载体pVAX1-IRES中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组真核表达载体;将pVAX1-E0-IRES-gD转染至293T细胞中,间接免疫荧光法检测目的基因在细胞中的表达情况;将pVAX1-E0-IRES-gD以不同剂量采用肌内注射的方式接种小鼠,通过抗体水平和细胞因子检测以及脾淋巴细胞增殖试验对该重组质粒的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒,目的基因在293T细胞内成功表达。在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这3个指标,重组质粒组均极显著高于空载体和阴性对照组,高剂量免疫组优于中、低剂量组;另外,高剂量重组质粒免疫组与二联灭活疫苗组相比无显著性差异。结果显示,成功构建了共表达BVDV E0和IBRV gD基因的重组质粒,体外表达检测证明目的蛋白具有良好的反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答。

牛病毒性腹泻病毒E0-E2基因融合腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价

【目的】研究牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2串联基因重组腺病毒作为基因工程疫苗的应用潜力。【方法】采用PCR扩增、E0-E2基因融合并构建重组穿梭质粒pDC316-E0-E2,将其与AdMax腺病毒系统的骨架质粒共转染HEK293T细胞包装成重组腺病毒,通过Western blotting进行验证,并通过Reed-Muench法测定病毒滴度,通过肌内、皮下免疫接种小鼠后用ELISA方法及流式细胞检测进行免疫效果试验。【结果】成功扩增到E0、E2基因目的片段,大小分别为681和1122 bp,得到了完整的腺病毒Ad5-E0-E2;测定其滴度为1.1×10^(10) PFU/mL;Western blotting检测结果显示,Ad5-E0-E2外源基因在HEK293T细胞中表达,得到了与预期相符的目的条带(65 ku);ELISA检测结果表明,通过肌内和皮下注射Ad5-E0-E2均能产生较高的抗体水平;流式细胞检测显示首免、二免后肌内和皮下注射Ad5-E0-E2组CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)比值均极显著高于PBS对照组(P<0.01)。【结论】本试验成功构建重组腺病毒Ad5-E0-E2,且具有较好的反应原性和免疫原性,能诱导机体产生针对BVDV的特异性抗体。

分泌表达牛病毒性腹泻病毒E0蛋白MDBK细胞的稳定性分析

目的:构建分泌表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白的MDBK细胞系,并探究其传代和冻存稳定性。方法:用实验室制备的BVDV E0基因重组慢病毒感染MDBK细胞,荧光观察并收集MDBK细胞培养上清进行Western印迹分析,通过qPCR方法检测重组细胞系中重组基因拷贝数变化。结果:IgK信号肽组和预测信号肽组均分泌表达E0蛋白;通过Oligo6.0软件设计BVDV E0基因SYBR GreenⅠ染料法荧光定量PCR检测引物,经过条件优化,未出现非特异性扩增,检测下线为20拷贝/μL;通过建立的荧光定量PCR和流式分析对2组细胞系进行传代稳定性分析,结果2组细胞系在第12代之后荧光率显著下降,15代之后E0基因拷贝数显著下降,2组细胞冻存前后荧光率未发现显著变化。结论:构建了稳定分泌表达BVDV E0蛋白的MDBK细胞系,建立了BVDV E0基因定量检测方法,为研究E0蛋白的生物学功能、探索BVDV的防控措施以及开发基因工程诊断抗原和基因工程亚单位疫苗奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a(+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。

牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与活性检测

参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)-ELISA抗体检测试剂盒的制备

为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试剂盒的准确性、灵敏性和稳定性。结果显示,抗原包被浓度为4μg/mL,1%酪蛋白溶液37℃封闭45 min,被检血清以1∶400稀释孵育30 min,兔抗牛HRP标记二抗以1∶20000稀释孵育30 min,TMB底物反应5 min时,ELISA的反应背景下降,区分度最好。优化后方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均在10%以内,表明该试剂盒具有较好的稳定性;灵敏性试验结果显示,当阳性血清稀释度达到1∶6400时仍可以检测为阳性,说明该试剂盒灵敏度较高;该试剂盒与美国爱德士生物科技公司(IDEXX)BVDV总抗体检测试剂盒共同检测466份临床血清样品,两者总符合率为89.1%;保存期试验结果显示,第4个月时该试剂盒仍能检测到阳性血清,说明稳定性较好。综上表明,本试验利用E^(rns)蛋白建立的BVDV间接ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高且重复性好,可为BVDV抗体检测和流行性调查提供新的方法。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗在怀孕母牛中垂直传播能力评价

本研究通过对怀孕母牛免疫牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗后检测胎牛组织中是否存在疫苗病毒,以评价该疫苗的垂直传播能力。试验将16头牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原和抗体阴性,怀孕60~90 d的母牛随机分成2组,第1组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。第2组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。母牛免疫后血清抗体转阳,BVDV抗体明显升高。免疫后第56 d剖取免疫牛的胎牛,采集胎牛脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织用病毒分离方法检测牛病毒性腹泻病毒。结果显示,所有怀孕母牛在整个试验期内无任何临床症状,也无流产现象。试验结束时胎牛发育良好,且未在胎牛的脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织中分离到牛病毒性腹泻病毒。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对怀孕母牛和胎牛都是安全的,无垂直传播。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性研究

本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液,2 mL/头。试验结果表明,免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状,也不引起白细胞水平的下降;仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒,在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4~6月龄的犊牛安全性良好。

不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。

宿主蛋白Rab11a对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)后,对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株,设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体,采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白表达情况;使用实时荧光定量qPCR、免疫荧光染色试验、Reed-Muench法等技术检测BVDV感染Rab11a KO细胞后病毒RNA水平、双链RNA(dsRNA)积累水平、病毒滴度及致细胞病变(CPE)情况等。Western blot检测结果显示,成功构建出Rab11a基因敲除的细胞Rab11a KO;Rab11a基因敲除显著抑制BVDV 5'UTR mRNA和dsRNA水平的积累,感染36 h后,Scramble细胞明显有大量细胞病变,出现皱缩、碎裂、形成空泡后脱落等现象,Rab11a KO细胞的CPE现象明显低于Scramble细胞;在BVDV感染细胞12 h后,与Scramble细胞相比,Rab11a KO细胞的病毒滴度显著性降低,结果证明了敲除MDBK细胞的Rab11a基因对BVDV在胞内复制起到抑制作用。本研究结果为了解宿主蛋白Rab11a与BVDV的相互作用,以及Rab11a对病毒的复制增殖的作用提供了新的科学依据。

规模牛场牛病毒性腹泻-黏膜病流行病学调查

[目的]掌握病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)在规模牛场3个品系牛间的感染状况,了解不同品系间BVDV感染是否存在差异。[方法]选择新疆师市范围内的19个规模牛场,分别饲喂中国荷斯坦奶牛(以下简称荷牛),弗莱维赫乳肉兼用牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称弗荷牛),挪威红牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称挪荷牛);共计采集血清样品7 965份,分别使用牛病毒性腹泻(BVD)实时荧光RT-PCR检测和牛病毒性腹泻ELISA方法检测抗原和抗体阳性率。[结果]实时荧光RT-PCR阳性总检出率为1.72%,荷牛阳性检出率为1.73%,弗荷牛阳性检出率为1.35%,挪荷牛阳性检出率为2.05%;场群阳性检出率为68.42%;3个品系的犊牛、青年牛、后备牛、成母牛均检测到BVDV,3个品系牛之间抗原阳性率差异不显著;牛病毒性腹泻ELISA方法检测阳性总检出率为36.69%,荷牛阳性检出率为37.11%,弗荷牛阳性检出率为36.74%,挪荷牛阳性检出率为34.02%,场群抗体阳性率为100%,3个品系牛之间抗体阳性率差异不显著。[结论]师市规模牛场3个品系牛均存在BVDV感染,且不同品系间BVDV感染率差异不显著。

牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的截短表达及多克隆抗体制备

本研究旨在克隆牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的非结构蛋白NS5B截短基因,采用原核表达系统表达获得截短蛋白,并进一步制备其多克隆抗体。构建的原核表达质粒pET-28a-NS5B转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导后,发现NS5B蛋白以包涵体为主。纯化蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有良好的反应性,能够特异性识别真核表达的NS5B蛋白。本研究中NS5B蛋白的截短表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NS5B蛋白的生物学功能,以及建立BVDV鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)对养牛业具有重大经济影响,而快速准确检测对于早期发现牛BVDV感染以便迅速采取针对性预防措施至关重要。常见的BVDV检测方法包括病毒分离鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。本文分别从病原学、血清学和分子生物学检测方面,对多种BVDV检测方法研究进展进行综述,分析每种检测方法的优势和局限性,提出了在实际应用中应根据不同需求选用不同的方法或综合应用多种检测技术的建议,以期为建立更加快速、实用和准确的BVDV检测方法及其应用提供参考。

新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定

新疆许多规模化牛场存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染,且因病毒基因型具有多样性,给该病的防控、疫苗选择、净化带来了一定的困难,开展新疆地区规模化牛场BVDV基因分型鉴定,对BVDV防控具有重要的指导作用。采集BVDV胶体金抗原检测卡确定为阳性的犊牛抗凝血样品并分离淋巴细胞,在MDBK单层细胞上进行病毒分离,盲传5代,提取培养物RNA,以BVDV5′-UTR、N^_(pro)特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分析。结果显示,获得BL分离株1株,属于BVDV-1m亚型,研究结果丰富了新疆南疆地区规模牛场BVDV分子流行病学数据库。

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒感染牛引起牛发生呼吸道疾病、免疫抑制及生殖障碍等特征的急性、高度接触性传染病。由于牛感染该病后与其他引起牛腹泻的病症类似,需要根据不同的情况选择相应的检测方法,及时切断BVDV牛群间的相互传播,减少因感染该病而造成的经济损失。因此,建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要。本文综述了牛病毒性腹泻病原及用于检测该病的检测方法,如病毒分离鉴定、RT-PCR、微滴式数字RT-PCR(dd-PCR)、纳米PCR、二温式PCR等检测技术,以期为牛病毒性腹泻的科学检测、诊断及防控提供理论基础。

一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌共感染的诊治

牛病毒性腹泻病毒能引起牛腹泻,而副结核分枝杆菌和弯曲杆菌同样能引起各个年龄段的牛腹泻,甚至流产,当3种病原共感染时,则会加重牛场的经济损失。该文通过一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌共感染病例,从发病情况、实验室检查、药敏试验、防治等方面进行阐述,旨在为防控这3种疫病提供参考。