一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌共感染的诊治

牛病毒性腹泻病毒能引起牛腹泻,而副结核分枝杆菌和弯曲杆菌同样能引起各个年龄段的牛腹泻,甚至流产,当3种病原共感染时,则会加重牛场的经济损失。该文通过一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌共感染病例,从发病情况、实验室检查、药敏试验、防治等方面进行阐述,旨在为防控这3种疫病提供参考。

一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌混合感染的诊治报告

牛病毒性腹泻病毒能够引起牛腹泻,而副结核分枝杆菌和弯曲杆菌同样能引起各个年龄段的牛腹泻,甚至流产,当三种病原混合感染时,则会加重牛场的经济损失。本文通过一起牛病毒性腹泻病毒、副结核分枝杆菌和弯曲杆菌混合感染的案例,从发病情况、实验室诊断、药敏试验、防治等方面进行论述,旨在为防控这三种疾病提供参考。

牛分枝杆菌脂多糖在动物结核病血清学诊断中的应用价值

目的:评价牛分枝杆菌脂多糖在动物结核病血清学诊断中的临床应用价值。方法:从灭活的牛分枝杆菌中提取具有生物活性的脂多糖,用提取的脂多糖进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),检测阴性牛血清和结核病、副结核病、布鲁氏菌病、口蹄疫、衣原体病和新孢子虫病阳性牛血清,判断脂多糖用于动物结核病诊断的特异性。同时,收集牛血清样本245份[结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)阳性177份,TST阴性68份],梅花鹿血清样本29份(TST阳性10份,TST阴性19份),獐子血清样本14份(TST阳性14份),通过ELISA方法检测血清中的抗体水平,以TST结果为参照,评估脂多糖在动物结核病血清学诊断中的临床应用价值。结果:除结核病阳性牛血清外,其余阳性病牛血清的检测结果与阴性牛血清差异无统计学意义(P>0.05),且均低于Cut off值。基于脂多糖建立的ELISA抗体检测方法与TST结果的总符合率为88.54%(255/288),总敏感度为87.56%(176/201),总特异度为90.80%(79/87)。结论:牛分枝杆菌脂多糖可作为动物结核病血清学诊断的特异性抗原之一,有助于提高现有诊断方法的特异性和检出率,具有较好的应用价值。

注射用母牛分枝杆菌对初治涂阳肺结核伴尘肺患者免疫功能的影响

目的探讨注射用母牛分枝杆菌对初治涂阳肺结核伴尘肺患者免疫功能的影响。方法将100例初治涂阳肺结核伴尘肺患者均分为对照组和试验组,2组均采用2HRZE/4HR方案进行化疗,化疗2周后试验组加用注射用母牛分枝杆菌、对照组加用生理盐水溶液,均持续治疗6个月,随访1年;比较2组患者治疗6个月时的结核病灶治疗有效率、空洞闭合率、结核杆菌涂片转阴率,比较2组患者治疗前及治疗6个月时的血清白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)水平及全血CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平,比较2组患者治疗期间的不良反应发生率及随访1年后的复阳率。结果治疗6个月时,试验组结核病灶治疗有效率、空洞闭合率、涂片转阴率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2组患者治疗6个月时的血清IL-10、TNF-α水平较治疗前降低,IFN-γ水平较治疗前升高,试验组变化更显著(P<0.05);试验组患者治疗6个月时的全血CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)较治疗前升高,全血CD8^(+)较治疗前降低,试验组变化更显著(P<0.05);随访1年,试验组复阳率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2组患者治疗期间的不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论使用注射用母牛分枝杆菌治疗初治涂阳肺结核伴尘肺患者,可有效减轻患者炎症反应,提高患者免疫功能,有助于改善患者病灶及空洞情况,提高涂片转阴率及降低复阳率。

结核分枝杆菌Lrp/AsnC家族蛋白的研究进展

结核分枝杆菌复合群是引起结核病(Tuberculosis,TB)的主要病原菌,其中结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)与牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是人类结核病的主要病原[1]。随着世界贸易的飞速发展及全球供应链的不断重构,人畜共患TB对全球人类及兽医卫生产生的负面影响不容小觑。2017年世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)数据统计,目前全球感染人畜共患TB人数约14.7万,死亡人数约1.25万[2]。更严峻的是,2019年全球约1000万人患TB,在COVID-19大流行背景下,TB死亡人数出现了十余年来的首次增加[3]。这将为2035年结束TB的战略目标带来严峻挑战,因此TB的防控和治疗刻不容缓。MTB之所以可以在宿主体内长期存在,最主要的是其通过利用自身精细而复杂的调控系统并进化出多种逃避宿主细胞的免疫应答策略来应对宿主缺氧、低pH和营养匮乏的恶劣环境。因此,进一步深入解析MTB的转录调控机制,明确其致病机制,探究新的潜在的抗结核药物靶点,并针对新靶点设计药物至关重要。

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测

目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。

结核变态反应阳性牛的非典型性分枝杆菌的分离与鉴定

本试验从６９头结核变态反应阳性牛中采取病料２０２份进行分枝杆菌、特别是非典型分枝杆菌的分离与鉴定，共获２６株分枝杆菌，除５株分伎杆菌外，其它全是非典型分枝杆菌。在这些非典型分枝杆菌中，５株偶发分枝杆菌、６株疾病分枝杆菌、５株鸟－胞内分枝杆菌、２株副结核分枝杆菌和１株ＲｕｎｙｏｎⅡ群。从病料看，有病变的分离率为４１．２％，无病变的为７．１％。在三种淋巴结病料中，以肠系膜淋巴结的分离率为最高（４６％），颌下淋巴结次之（３０％），肺门淋巴结为最低（２４％）。

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达

目的 构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法 以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果 重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论 成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan~荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。

10株牛源非结核分枝杆菌16S rRNA基因序列分析

本研究应用结核分枝杆菌的16S rDNA序列分析方法,鉴定非结核分枝杆菌菌株。应用PCR方法从10株牛源非结核分枝杆菌中扩增16S rDNA基因5'端片段并测序。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank中分枝杆菌序列相比较,计算种间相似性,构建系统发育树,对菌株进行分类与鉴定。结果显示,10株牛源非结核分枝杆菌中浅黄分枝杆菌1株;偶发分枝杆菌1株;母牛分枝杆菌2株;新金色分枝杆菌4株;另有2株N8和N9分别与新金色分枝杆菌和偶发分枝杆菌有较好的亲缘关系。检测结果提示,非结核分枝杆菌在牛群中存在应引起重视,而且它们对人畜的致病性需要进一步研究,以便采取有效的防制措施确保人类及畜群的健康。

牛结核分枝杆菌特异性核酸探针的克隆与分析

牛结核分枝杆菌是引占结核病的致病源，其染色体ＤＮＡ中含有插入序列ＩＳ１０８１，属于结核杆菌类特异性基因片段，在牛结核杆菌染色体中含有６个拷贝。目前国外普遍有杉该片段作为探针对牛结核病进行鉴定和诊断。本试验采用牛结核分枝杆菌染色体Ｄ避的特民插入片段即ＩＳ１０８１为模闰于ＩＳ１０８１中４３８－４５９和６６４－６８５碱基 的两个片段为引物。利用ＰＣＲ技术扩增出一段２４８ｂｐ的特异性片段。

母牛分枝杆菌菌苗免疫辅助治疗老年初治空洞型肺结核的疗效分析

目的探讨母牛分枝杆菌菌苗联合化疗对老年免疫功能低下的空洞型肺结核的疗效。方法 64例老年免疫功能低下初治空洞型肺结核患者随机分为治疗组33例和对照组31例,治疗组在对照组常规抗结核方案基础上,联合母牛分枝杆菌菌苗治疗。结果治疗2月末的痰菌阴转率、病灶及空洞治疗有效率,血清白蛋白,CD4+T淋巴细胞数,CD4+/CD8+T细胞;治疗6月末的痰菌阴转率、病灶及空洞治疗有效率,治疗组均较对照组明显升高(P<0.05)。结论母牛分枝杆菌菌苗能明显改变老年CD4+T淋巴细胞低下的初治空洞型肺结核患者的细胞免疫功能,加快病变的吸收和痰菌的阴转速度,对结核病的治疗有辅助作用。

牛结核分枝杆菌Mce4E蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOs、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

探讨Mce4E蛋白在牛结核分枝杆菌致病机理中的作用。以Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞24和48h后,MTT检测分析表明,Mce4E蛋白对巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P<0.05);用重组表达的Mce4E蛋白、人分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.tuberculosis,MtbPPD)、牛结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.bovis,MbPPD)、卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)和刀豆蛋白A(con-canavalin A,ConA)分别刺激肺泡巨噬细胞48h后,real-time PCR方法检测显示,Mce4E蛋白能够促使牛肺泡巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达上调(P<0.05)、抑制肺泡巨噬细胞iNO的mRNA表达(P<0.05)而对IL-12表达没有影响(P>0.05)。Mce4蛋白能够促使肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子,并对肺泡巨噬细胞有抑制作用,证实Mce4蛋白在分枝杆菌中具有重要的作用。

牛结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立可应用于快速检测奶牛结核病、评估鲜乳污染状况、追溯传播途径的试验方法,本研究根据牛结核分枝杆菌基因组设计合成特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化,构建标准曲线,评价该方法的性能。结果显示,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法能有效检测牛结核分枝杆菌目的基因,其最佳引物浓度为400nmol/L,最佳退火温度为52℃。所构建的标准曲线相关性好,可用于样本的定量检测。该方法的性能评价显示,其最小检出模板浓度为80.24ng/L,且该方法具有较好的特异性、可重复性,可对鲜乳样本进行检测。试验结果表明,本研究所建方法可用于牛结核分枝杆菌的定性和定量检测,这为奶牛结核病的诊断与净化及鲜乳食品安全评估提供重要技术。

应用噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌的方法研究

建立噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌试验方法,探讨最佳检测条件。比较各种检测方法对测定结果的影响。结果:噬菌体工作浓度为1×108PFU/ml、37℃感染2h,杀毒剂浓度在100mmol/L、室温作用10min为最佳检测条件。指示细胞浓度在1×106条/ml时,形成噬菌斑清晰,便于计数。结论:在选择最佳测定条件下,噬菌体生物扩增法检测牛结核分枝杆菌,快速、简便、灵敏。

采用限制性酶切片段长度多态性和PCR指印技术对牛结核分枝杆菌分型研究

5株牛结核分枝杆菌DNA经PvuⅡ消化后 ,用来自IS10 81中的 2 48bp荧光探针杂交后进行限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)分型 ,5株牛分离株中有 4株具有相同杂交带型 ,剩余的 1株在 3.6kb处多了 1条带。将 2 48bp探针对北京牛结核分枝杆菌分离株的RFLP分型法结果与直接反向PCR分型法对上述分离株分型结果比较发现 :5株牛结核分枝杆菌分离株中有 2株具有相同的PCR指印带型 ,剩余 3株牛结核分枝杆菌分离株则PCR指印带型各不相同 ,上述结果显示出 ,直接反向PCR分型法较标准的RFLP分型法分型能力强。直接PCR法对新疆牛结核分枝杆菌分离株的分型结果显示出 ,PCR指印带型中带数较少 ,且与北京牛结核分枝杆菌分离株的PCR指印带型截然不同。

牛结核分枝杆菌基因文库的构建

以国际标准牛型结核分枝杆菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＴＭＣ４１０为材料，制备其总ＤＮＡ，经过限制性内切酶Ｓａｕ３Ａ部分消化后，纯化回收９～２５Ｋｂ片段，并将其用Ｔ４ＤＮＡ连接酶与经ＢａｍＨＩ酶切为粘性末端的ＬａｍｂｄａＥＭＢＬ３左右臂连接。用噬菌体包装蛋白包装，再进行连续稀释，然后将不同稀释度的噬菌体转移到宿主菌ＬＥ３９２。所获重组子为６×１０４，因为牛结核杆菌基因组大小约为４×１０６Ｋｂ则以９９％概率筛到任一基因，要求的重组子数为１．０８×１０３。

牛结核分枝杆菌MPB70蛋白分泌性载体的构建与蛋白表达

为了研究牛结核病新型诊断抗原,试验根据GenBank中Mycobacterium bovis基因序列设计1对引物,将牛结核分枝杆菌MPB70基因构建到pET22b(+)原核表达载体上,将重组载体转到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导获得高效表达,并进行SDS-PAGE和Westen-blot分析。结果表明:MPB70蛋白以可溶形式在细胞周质中表达,有部分蛋白以包涵体形式在细胞质中表达,其分子质量约为30ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;重组MPB70蛋白可与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。说明重组MPB70蛋白能够作为诊断抗原。

牛非结核分枝杆菌分离与鉴定

本试验对从吉林省不同区域的7个城市采集的503份牛颌下淋巴结样品和497份牛肠系膜淋巴结样品进行非结核分枝杆菌的流行情况的调查,样品均采自结核(副结核)变态反应阴性牛只,调查中得到阳性样品25份,阳性率2.5%,其中颌下淋巴结阳性率1.59%,肠系膜淋巴结阳性率3.42%,成功分离扩增培养出14株非结核分枝杆菌,并进行了分类鉴别,得到母牛分枝杆菌1株,龟分枝杆菌脓肿亚种2株,苏加分枝杆菌2株,偶发分枝杆菌1株,蟾蜍分枝杆菌6株,胞内分枝杆菌2株。调查结果表明:非结核分枝杆菌单独感染的情况不容乐观,应加强对非结核分枝杆菌的检验检疫工作。

DHPLC与SURVEYOR酶法在结核和牛分枝杆菌鉴别中的尝试

目的牛分枝杆菌与结核分枝杆菌由于99%以上的基因序列相同,从分子生物学角度很难鉴别。本工作从牛分枝杆菌存在pncA基因C169G突变和oxyR基因G285A的不同出发,利用DHPLC和SURVEYOR酶法进行测定,以探讨这两种以异源双链分析为基础的基因突变检测的新方法在这两种分枝杆菌鉴别中的应用。方法DHPLC法和SURVEYOR酶法分析结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的pncA及oxyR基因。结果牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的DHPLC图谱和SURVEYOR酶法的电泳图谱显著不同,很容易将两者区分开来。结论DHPLC法和SURVEYOR酶法稳定,灵敏,简便,快速,在结核与牛分枝杆菌的鉴别中有一定的作用。