牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒四重一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)的方法,根据BVDV 5'UTR基因、BEV 5'UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。

广西地区水牛E2型牛肠道病毒的分离和鉴定

为了解广西地区水牛感染中肠道病毒(BEV)的情况,本研究在广西南宁某水牛规模养殖场腹泻粪便样品中成功分离出2株BEV,分别命名为GXNN2106和GXNN2102。将2株病毒空斑纯化后测定GXNN2106毒株TCID 50为107.99/0.1 mL,GXNN2102毒株TCID 50为107.37/0.1 mL。多步生长曲线结果显示,GXNN2106毒株在MDBK细胞中复制增殖良好。经BEV VP 1、5′UTR特异性引物逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定,2株病毒均属于E2型,与其他E2型BEV 5′UTR核苷酸同源性为75.7%~78.6%,VP 1核苷酸同源性为87.1%~91.1%。本研究首次在广西地区水牛粪便中分离得到E2型BEV毒株,为广西水牛源牛肠道病毒的流行分布情况和疫苗的研发提供数据支持。

广西河池地区牛肠道病毒和牛冠状病毒流行病学调查及遗传变异分析

为了解广西壮族自治区河池地区牛肠道病毒(BEV)和牛冠状病毒(BCoV)的流行情况及毒株序列特征,本试验应用TRIzol法抽提核糖核酸(RNA),采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对2021—2022年广西河池各地区采集得到的422份粪便样品进行病原检测及遗传变异分析。结果显示,广西河池地区BEV的检出率为3.23%~19.51%,BCoV的检出率为2.44%~4.62%,BEV和BCoV混合感染率为2.44%~4.44%。按照不同品种牛群对BEV和BCoV检测结果进行分析,结果显示,西门塔尔杂交牛BEV感染率为13.99%,BCoV感染率为2.07%;本地黄牛BEV感染率为9.00%,BCoV感染率为0.95%;杂交水牛BEV感染率为33.33%,BCoV未发现感染;安格斯牛BEV和BCoV均未发现感染。按照不同年龄对BEV和BCoV检测结果进行分析,结果显示,0~180日龄BEV感染率为22.11%,BCoV感染率为4.21%,大于180日龄牛群BEV感染率为7.95%,BCoV感染率为0.61%。按照不同养殖模式对牛群BEV和BCoV检测结果进行分析,结果显示,农户养殖BEV感染率为12.06%,BCoV感染率为1.42%,合作社养殖BEV感染率为9.29%,BCoV感染率为1.43%。遗传变异分析结果显示,广西河池地区存在E、F型2种BEV感染,检出E型BEV 21份,检出F型BEV 26份。本试验首次揭示了广西河池地区BEV和BCoV的流行病学调查数据,为广西乃至全国牛肠道病毒和牛冠状病毒净化防控提供了理论参考数据。

天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究

为分析天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛肠道病毒(BEV)的复制,本研究以不同浓度的BBM与牛肾细胞(MDBK)共孵育后,采用MTT法检测BBM对MDBK细胞的影响,结果显示,与对照浓度相比,1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L BBM对细胞增殖抑制作用均较小(P>0.05)。因此选择上述3种浓度的BBM分别处理MDBK 12 h后以103TCID50BEV感染,24 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测BEV双链RNA(dsRNA),以确定BBM对BEV的最佳抑制浓度。MDBK细胞经10μmol/L BBM处理后感染BEV,观察48 h内BEV致细胞病变效应(CPE),采用荧光定量PCR检测BEV 5'UTR m RNA转录水平及测定子代病毒滴度,以确定BBM体外对BEV的抑制效果。IFA结果显示,与对照组相比,10μmol/L BBM对BEV ds RNA具有极显著性抑制作用(P<0.01);细胞形态观察结果显示,BBM对BEV引起的细胞大面积脱落具有一定的抑制效果;荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,在感染48 h的细胞中BEV 5'UTR m RNA转录水平极显著降低(P<0.01);子代病毒滴度测定结果显示,在BEV感染24 h和36 h时子代病毒滴度极显著降低(P<0.01)。小鼠预防试验时将24只BALB/c小鼠均分为3组,分别为对照组(0)、低剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg),每日将BBM灌胃1次。给药后3 d滴鼻感染1015TCID50BEV,间隔48 h重复感染一次。感染后分别于5 d、10 d剖杀各组小鼠并采集各组织,采用荧光定量PCR检测BEV 5'UTR m RNA的转录水平。小鼠感染治疗试验时将48只BALB/c小鼠均分为BEV阳性对照组(BEV/DMSO)、感染给药组(BEV/BBM)、给药对照组(BBM),BEV阳性对照组和BEV/BBM组小鼠滴鼻感染1015TCID50BEV后,各组每天按原剂量灌胃BBM一次,感染后0、3 d、6 d和10 d剖杀各组小鼠并采集各组织,检测BEV 5'UTR m RNA的转录水平,并制备病理切片观察各组织的病变。BALB/c小鼠预防试验结果显示,各浓度BBM均具有显著或极显著抑制BALB/c小鼠肝、脾、肾、小肠组织中BEV 5'UTR m RNA转录水平升高的作用(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,各浓度BBM均具有减轻各组织病变作用。其中高剂量组预防效果最明显,且随给药时间延长预防效果也最好。小鼠治疗试验结果显示,感染BEV后灌胃BBM当日即可抑制BEV在小鼠组织中的复制;病理学观察结果显示,对感染对照组相比,BBM可减轻小鼠各组织充血、出血、炎性细胞浸润等情况。综上所述,本研究首次证实BBM在体内外均具有抑制BEV复制的作用,为牛腹泻病的治疗及开发BBM抗病毒药物提供参考依据。

基于牛肠道病毒重组VP2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为了解牛肠道病毒(bovine enterovirus, BEV)在我国牛群中的感染情况,建立了基于BEV VP2蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果发现重组VP2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶性形式表达。间接ELISA检测方法其抗原包被最佳浓度为100 ng/孔,最佳封闭条件是10%马血清封闭1.5 h,一抗最佳稀释度是1∶100,二抗最佳稀释度是1∶200。该方法具有良好的特异性、重复性和灵敏性,与间接免疫荧光方法相比较,符合率为92.3%。对全国7个不同省市的1 964份牛血清样本进行检测,显示总体阳性率为52.6%,表明BEV已在我国牛群中普遍流行。本试验建立的BEV抗体间接ELISA方法,为BEV感染的诊断和血清学调查提供了技术支撑。

牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒的流行病学调查分析——以辽宁铁岭地区为例

[目的]了解辽宁铁岭地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)的流行病学情况。[方法]对2021年6月至2022年6月辽宁铁岭地区不同奶牛场进行BVDV、BEV的发病情况调查,采集648份病样进行抗原检测。[结果]辽宁铁岭地区不同奶牛场BVDV单一感染率为19.14%,BEV单一感染率为14.97%,BVDV/BEV混合感染率为8.64%,其中不同年龄牛群均存在不同程度的BVDV和BEV混合感染,犊牛混和感染率最低,为4.49%(4/89);育成牛混和感染率为6.35%(12/189);青年牛混和感染率最高,为13.01%(19/146);成母牛混和感染率为9.38%(21/224)。[结论]本研究揭示出辽宁铁岭牛群感染BVDV、BEV的流行病学本底,为进一步防控BVDV与BEV感染提供了可靠的流行病学理论依据。建议对于饲养密度高、规模较大的奶牛场应当定期进行全面的流行病学调查,掌握BVDV、BEV的流行规律。

牛肠道病毒2型的分离与鉴定

本研究从北京某牛场发生严重腹泻的泌乳奶牛采集直肠拭子,接种MDBK细胞,分离获得1株病毒,命名为BJ001。理化特性鉴定结果表明,该病毒大小约30nm,为无囊膜的RNA病毒;用随机PCR方法对氯化铯梯度离心后的各区带扩增,扩增产物凝胶电泳后,回收"呈彗尾样拖带现象"最明显的区带2的500～1 500bp的片段进行序列测定与分析,结果显示,扩增片段与GenBank中已知的牛肠道病毒2型相似性较高;用BEV2型特异性引物对病毒进行RT-PCR扩增,并将扩增产物进行序列测定与分析,结果表明,其与BEV2相似性最高可达93%。故该病毒被确定为牛肠道病毒2型。将该病毒接种2头成年健康奶牛,均未出现肉眼可见的临床症状,但病毒可在接种奶牛体内持续存在,并产生较高滴度抗体。

牛肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5'UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化。该方法对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1 mL,敏感性比病毒分离法高10倍。而且该方法对其他牛相关病毒均无交叉反应。用3批试剂对3个稀释度的BEV培养物进行批内和批间重复性试验,其变异系数均小于1.1%,表明该方法具有良好的重复性。采用该方法对北京周边地区牛群采集的852份临床样品进行检测,并与病毒分离方法比较,两种方法检测结果完全一致。因此,本研究所建立的BEVTaqMan RT-PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为国内BEV的检测提供了有力的技术支持。本研究首次通过病毒核酸检测证明了我国部分地区的牛群中存在BEV感染。

牛肠道病毒的分离鉴定

本研究从内蒙古某奶牛场的犊牛粪便样品中分离的一株牛肠道病毒(BEV),命名为BHM26,通过电镜观察显示和分子生物学鉴定,发现病毒粒子在细胞浆中呈结晶状排列,单一病毒粒子呈典型小RNA病毒粒子形态,直径为25nm～30nm,无囊膜;病毒的部分3D蛋白编码区和全长3'UTR区段的1026bpDNA片段的RT-PCR扩增和序列分析表明,其核苷酸序列与GenBank登录的参考病毒株核苷酸序列同源性为71.9%～87%,其中与BEVWye-3A株同源性最高,为87%。分析表明中国BEV分离株与国外参考毒株具有较大差异。

牛肠道病毒2型VP1^+表达和间接ELISA方法的建立与应用

根据2005年从北京某牛场分离得到的一株牛肠道病毒2型(BEV-2)毒株序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增BEV-2包含VP1(840 bp)蛋白基因片段的VP1+(1 275 bp)序列,扩增产物克隆到p MD-T19,进行测序验证。验证该序列为目的片段后,将其克隆到表达载体p ET-32a。重组质粒转化至Rosetta,经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示重组蛋白在大肠杆菌中高效表达。将重组蛋白作检测抗原包被酶标板,成功建立了检测牛肠道病毒2型抗体的间接ELISA方法。上述工作,为下一步BEV-2单克隆抗体的制备打下了基础。

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。

同时检测口蹄疫病毒和牛肠道病毒双重RT-PCR方法的建立

为建立同时检测口蹄疫病毒(FMDV)和牛肠道病毒(BEV)的双重RT-PCR方法,本研究根据已发表的FMDV和BEV基因的5'UTR保守区域,分别设计、筛选出一对特异性引物建立了双重RT-PCR方法,并优化了反应体系和条件。采用该方法检测其他几种牛相关病毒结果均为阴性,表明特异性良好。该方法对FMDV的最低检出限为8 TCID50/0.1 mL,对BEV的最低检出限为2 TCID50/0.1 mL,表明其具有良好的敏感性。采用该方法检测了852份临床样品,并与病毒分离方法比较,结果两种方法检测结果完全一致。本研究首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快速检测方法,该方法的建立为FMDV和BEV的检测提供了一种技术手段。

一株牛肠道病毒的分离与鉴定

本研究从内蒙古某牛场患呼吸道病牛鼻拭子中分离到1株病毒,命名为NM575,并对其进行了鉴定。分离的病毒能够抵抗100μg/m L的DNA抑制剂5-溴脱氧尿苷,确定为RNA病毒。电镜观察可见无囊膜球形的病毒粒子,直径约30 nm,与小RNA病毒形态学特征相符。理化特性鉴定结果表明分离病毒对乙醚、氯仿及胰酶具有一定抵抗力,耐酸,对热敏感,与牛肠道病毒特性相符。应用牛肠道病毒P1基因的特异性引物,通过RT-PCR可从病毒细胞培养物中扩增出特异性片段,对其进行序列测定并与Gen Bank中登录的牛肠道病毒参考毒株及其他种属的肠道病毒参考株相应的序列进行比对及系统进化分析,结果显示分离毒株NM575与牛肠道病毒BHV-261株的核苷酸同源率为80%,进一步说明分离株为牛肠道病毒,且基因分型为EV-F1。病毒的体外细胞培养嗜性试验结果显示,NM575株可感染牛、仓鼠、猪、犬和鸡等多种动物细胞,尤其在牛源细胞中复制滴度最高,为10^(7.6) TCID_(50)/m L。综合以上结果分析确定所分离的病毒株NM575为牛肠道病毒,这是我国首次从患呼吸道病牛鼻拭子中分离获得。

牛肠道病毒2型单克隆抗体的制备及其应用研究

旨在制备牛肠道病毒2型(BEV-2)单克隆抗体,建立检测BEV-2抗原的ELISA方法。将纯化的BEV-2VP1+重组蛋白质接种BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0用PEG4000进行融合,对杂交瘤培养上清进行筛选,获得2株稳定分泌抗BEV-2VP1+蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1G1、5G6)。用制备的单克隆抗体包被酶标板,通过一系列的优化,建立了BEV-2双抗夹心ELISA检测方法。建立的ELISA方法检测BEV-2病毒量的最低限为100TCID50·0.1mL-1,与BVDV、IBRV、BLV等病毒无交叉反应。本研究首次制备了牛肠道病毒2型单克隆抗体,建立了检测BEV-2抗原的双抗体夹心ELISA方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为进一步研究和开发快速诊断牛肠道病毒试剂盒奠定了基础。

牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展

牛肠道病毒(BEV)感染是我国近年来的新发传染病,在牛群中普遍存在,且常与其他病原体发生混合感染和继发感染。本文介绍了牛肠道病毒的发现、形态及分类、流行病学特点等,阐述了该病毒检测技术的研究进展,如病毒的分离培养技术、血清学检测技术、分子生物学检测技术(RT-PCR技术和实时荧光定量RTPCR技术)等,以期为预防和控制该病提供参考。

牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展

牛肠道病毒(BEV)感染为国内近年来的新发传染病,在牛群中普遍存在,且常与其他病原体发生混合感染和继发感染,导致牛群出现较高的死亡率,给养牛业造成巨大的经济损失。本文概述了牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展,以期为预防和控制该疾病提供参考。

一株牛肠道病毒的分离与鉴定

本研究从山西某奶牛场的泌乳奶牛粪便样品中分离得到一株牛肠道病毒（BEV），命名为HLJ-3531／2013。理化特性鉴定结果表明，该病毒粒子呈典型小1KNA病毒粒子形态，直径为25～30nm，无囊膜；该病毒在pH3～9时稳定，对氯仿、乙醚、胰酶等均有一定的抗性，但50℃可迅速被破坏，1mol／LMgSO4能显著提高该病毒对热的抵抗力。采用随机引物通过RT—PCIK扩增获得病毒部分VP2及VP4蛋白编码区的DNA片段，序列分析结果表明，其核苷酸序列与GenBank登录的参考病毒株核苷酸序列同源性为65．0％－79．2％，其中与德国分离株D3／98株同源性最高，为79．2％。进化树分析其可能为EV—E种群中新的基因型。此前中国已分离得到的三株牛肠道病毒均为EV-F，该病毒株与中国已分离株分属于不同的血清型。

牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展

牛肠道病毒(BEV)感染为国内近年来的新发传染病,在牛群中普遍存在,且常与其他病原体发生混合感染和继发感染,导致牛群出现较高的死亡率,给养牛业造成巨大的经济损失。文章概述了牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展,以期为预防和控制该疾病提供参考。

牛肠道病毒的研究进展

国内近几年牛肠道病毒病已经开始逐渐流行,现已发现多株新型病毒株并对此建立了多种分子及血清型方面的检测方法。通过对牛肠道病毒的基本结构、鉴定方法、检测方法、流行情况以及致病机制进行详细的介绍,以期为更好的研究牛肠道病毒在我国的流行现状及防治措施提供依据。

宿主蛋白核仁素与病毒基因组相互作用对牛肠道病毒复制影响的研究

为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达。结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达。在此基础上,将BEV以MOI 1感染上述过表达和下调NCL表达的BHK-21细胞,于感染8 h、10 h和12 h时收集上清液和细胞,采用qPCR、western blot(检细胞)分别检测病毒基因组RNA的复制水平、BEV结构蛋白VP1表达水平及通过上清液检测病毒滴度的变化。结果表明,过表达NCL明显促进BEV在BHK-21细胞中的复制,而下调NCL的表达则明显抑制BEV的复制。利用兔源NCL特异性抗体及同源IgG对感染BEV的BHK-21细胞进行RNA免疫共沉淀试验,并利用RT-PCR检测免疫复合物中BEV相应基因片段。结果显示,免疫复合物NCL抗体-NCL蛋白-病毒RNA免疫复合物中扩增出BEV目的基因片段,而IgG抗体对照组未扩增出任何条带,表明NCL与BEV基因组RNA存在相互作用。通过激光共聚焦试验观察BEV感染BHK-21细胞后不同时间(5 h和10 h)NCL蛋白的亚细胞定位,结果显示,BEV感染细胞后使NCL由核仁迁移至细胞质,并与病毒基因组在细胞质中共定位。利用同源重组试剂盒将线性化的pmirGLO及扩增的BEV内部核糖体进入位点(IRES)构建双荧光素酶报告质粒pmirGLO-BEV IRES,并经测序鉴定正确后分别转染NCL过表达和下调表达的BHK-21细胞,采用双荧光素酶试剂盒分别检测上述细胞中两种荧光素酶FLuc和RLuc(BEV IRES依赖性的)的活性。结果显示,与转染pHA的对照细胞相比,NCL过表达的BHK-21细胞中FLuc值无显著变化,而RLuc值显著升高(P<0.01);与转染shRNA NC的对照细胞相比,NCL表达下调的BHK-21细胞中,FLuc值无显著变化,而RLuc值显著降低(P<0.01)。表明,NCL正调控BEV IRES的翻译起始活性。本研究首次证实NCL与BEV基因组间存在相互作用,该互作可促进BEV IRES介导的病毒蛋白翻译活性,从而提高BEV的复制水平,为BEV复制的分子调控机制提供了新的见解。