脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染

为获得转基因克隆牛的供体细胞，采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞，经2～3次传代纯化，绘制生长曲线，分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征。分别采用800、900、1000V／cm和1、5、10、15和20ms的参数组合，将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞，经800μg／mLG418筛选2周，继续以300μg／mLG418扩大培养2～3代，取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明，体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛，体外传代20次后核型未发生改变；转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达，筛选后各组克隆形成数以900V／cm和5ms组最多；PCR检测得到了预期条带，说明目的基因已经成功导入。分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体，进行转基因克隆研究。

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。

小鼠胎儿和牛睾丸成纤维细胞的冷冻保存

研究了冷冻保护液、平衡时间、降温速度、解冻液以及解冻方式对冷冻小鼠胎儿成纤维细胞和牛睾丸成纤维细胞活力的影响。结果表明 ,对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻 ,冷冻液 ( 0 .4 %BSA) +1 .5mol/ L乙二醇 +0 .1 mol/ L蔗糖的 PBS液 )的冷冻效果优于冷冻液 ( 1 0 %的 NBS+1 0 %DMSO的 DMEM液 )。用冷冻液 对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻 ,平衡时间可从 2 .5h缩短到 0 .5h;冷冻细管降温速度 ( -6.8～ -3 7℃ )可以从 0 .6℃ / min提高到 1 .2℃ / min;诱发结晶可以省略。 3种解冻液解冻细胞活力排序为 :解冻液 ( 0 .4 %BSA+0 .1 mol/ L蔗糖的 PBS) >解冻液 ( 1 0 %NBS的 DMEM) >解冻液 ( PBS)。用冷冻液 对 MEF和 BTF细胞冷冻过程中 。

培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响

采用单细胞培养法和组织块培养法从原代培养人胎儿成纤维细胞,并在不同体积分数胎牛血清(FBS)(0%、4%、8%、10%、12%)的条件下观察人胎儿成纤维细胞培养的状况并采用台盼蓝染色法进行活细胞计数.结果表明,早期由组织块培养法原代培养获取的细胞形态要比单细胞培养法原代培养获取的细胞稍好些,且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞.FBS对hFFs生长影响比较明显.在实际应用中,在体积分数8%FBS下,采用组织块培养法进行人胎儿成纤维细胞体外培养,效果良好.

牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染。克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体。用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24h后观察荧光表达,48h后加入600μg.mL-1 G418,筛选1周,300μg.mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养。对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析。结果,转染24h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEG-FP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1 500bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体。说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性。可以作为核移植进行转基因克隆牛研究。

牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养

本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻。

爪蟾卵母细胞抽提物可诱导牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程

应用非洲爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(Japanese Black cattle fetal fibroblasts,JBCFF),观察处理前后细胞的形态学变化,同时用免疫荧光染色法检测组蛋白的乙酰化状态和OCT4蛋白的表达,并对其多能性标志基因的mRNA表达水平进行定量分析。结果表明,与未处理细胞相比,经抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞组蛋白H3K9乙酰化程度与未处理组无显著差异;培养5~6d后细胞聚集形成'克隆簇'中碱性磷酸酶和Oct4蛋白染色阳性;同时也检测到Oct4和Nanog基因在其中的表达,而Sox2基因未见表达;且Oct4、Nanog基因表达量随处理后细胞培养时间的延长(4、5、6d)而呈依次上升趋势。可见,爪蟾卵母细胞抽提物能诱导和牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程,恢复其发育全能性,这对牛诱导性干细胞制备方法的探索和体细胞克隆及转基因克隆牛效率的提高具有一定的借鉴意义。

转乳铁蛋白肽和α干扰素基因的牛胎儿成纤维细胞的制备

旨在构建含有乳铁蛋白肽基因和α干扰素基因的载体,并制备转基因牛胎儿成纤维细胞,为研制抗乳房炎和口蹄疫转基因克隆牛提供供体细胞。本研究构建了由山羊β-酪蛋白启动子启动的牛乳铁蛋白肽基因和由CMV启动子调控的人α干扰素基因的载体,以EGFP基因作为报告基因,neo基因作为筛选基因;分别采用脂质体和电击法转染牛胎儿成纤维细胞,G418筛选得到转基因阳性细胞,并用PCR方法检测转基因细胞中目的基因的整合情况,用Western blotting检测α干扰素蛋白的表达。结果,得到了同时含有牛乳铁蛋白肽基因和人α干扰素基因的转基因牛胎儿成纤维细胞,并且α干扰素蛋白在转基因细胞中能有效表达。

固醇调节元件结合蛋白基因的过表达对促进牛胎儿成纤维细胞脂肪形成的影响

为了研究固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding factor 1,SREBP1)基因的表达与细胞脂肪形成的关系,本研究构建了pEGFP-C1-SREBP1重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-C1-SREBP1及pEGFP-C1空质粒转染至牛胎儿骨骼肌成纤维细胞培养48h,实时荧光定量PCR和Western blotting分析目标基因表达水平的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果发现,pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染细胞内SREBP1mRNA的表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);SREBP1蛋白也出现明显上调;空白对照组和pEGFP-C1阴性对照组细胞内均未见有红染细胞,而pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染组中出现了清晰的红染细胞。说明SREBP1的表达可促进牛胎儿骨骼肌成纤维细胞脂肪合成,证实牛胎儿成纤维细胞中SREBP1表达和脂滴形成之间存在直接关系。

敲减MC4R表达对牛胎儿成纤维细胞CMS系统关键因子的影响

为获得敲减黑素皮质素4受体(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因的牛胎儿成纤维细胞,并探讨其在能量平衡神经调节系统中的作用,将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体pGSH1-GFP-MC4R,利用阳离子脂质体转染牛胎儿成纤维细胞并使用G418筛选稳定转染细胞株.利用实时荧光定量和Western印迹检测MC4R及中枢黑素皮质素系统(central melanocortin system,CMS)关键因子的表达水平变化.结果表明,在稳定转染的牛胎儿成纤维细胞系中,MC4R表达显著抑制,瘦蛋白(leptin)和阿黑色素原(POMC)表达下调,黑素皮质素拮抗物agouti相关蛋白(AGRP)和MC3R表达上调,而神经肽Y(NPY)表达无明显改变.综上所述,本研究成功获得了敲减MC4R基因表达的牛胎儿成纤维细胞.相关基因表达水平检测结果提示,MC4R的表达水平对CMS系统中的各关键基因的表达有不同的抑制或促进影响.

双标记选择载体转染牛胎儿成纤维细胞方法的建立

以经SspI和BamHI对所构建的双标记选择载体质粒pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB双酶切后的线性目的DNA为外源基因,对电击介导的牛胎儿成纤维细胞基因转染方法的效率进行了优化.实验结果表明,当电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms时可获得约50个阳性细胞克隆/10 5 个细胞的最佳转染效率.通过牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418抗性的敏感性实验确定800μg/mL G418为快速筛选浓度,以300μg/mL G418为维持筛选浓度.从两个牛胎儿成纤维细胞系中共分离了56个绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞克隆,从中选取2个冷冻保存.经PCR检测,证实2个冷冻克隆株均含有所转染的外源基因.

牛胎儿成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因

为利用核移植法获取转基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛胎儿成纤维细胞并进行了携带线虫ω-3脂肪酸去饱和酶cDNA的表达载体转染。首先采用组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染牛胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2～3次后利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明,组织块贴壁后7天可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9天即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶cDNA整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶mRNA在转基因传代细胞中得到有效转录,为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了基础。

转绵羊IRF-1基因牛胎儿成纤维细胞的BVDV抗性研究

为研究IRF-1基因在抗病毒方面的作用,将IRF-1基因转染牛胎儿成纤维细胞,制备了瞬时表达IRF-1基因的转基因细胞,再将携带单股正链RNA的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作用于上述转基因细胞,观察该病毒在转基因细胞和非转基因细胞上的滴度变化及2种细胞形态、增殖、凋亡和基因表达情况上的差异。结果显示:与非转基因细胞相比,病毒在转基因细胞上滴度显著提高,病毒作用48和72 h后转基因细胞病变程度明显低于非转基因细胞;流式细胞仪检测发现72 h时细胞凋亡率显著降低,荧光定量PCR检测结果显示,转基因细胞中IRF-1基因的表达水平显著提高。结论:IRF-1基因具有促进细胞抗BVDV感染的作用。

秦川牛胎儿成纤维细胞表达A-FABP基因条件的优化和鉴定

为了向转基因牛提供过表达A-FABP的供核细胞,本研究从NCBI中查找牛脂肪型脂肪酸结合蛋白(Albert,A-FABP)基因全长cDNA序列,通过简并密码子的方法设计特异性引物。A-FABP基因通过公司合成,与pEGFP-C1载体连接形成重组质粒pEGFP-C1-A-FABP。分离获得3株秦川牛胎儿成纤维细胞(battle embryonic fibroblast,BEF),分别用DMEM和D/F12进行培养,随机选择一株细胞优化外源基因转染条件。用优化的条件转染这3株细胞,800μg/mLG-418进行筛选,挑取单克隆,获得稳定转染A-FABP的细胞株。PCR和RT-PCR检测细胞A-FABP基因的表达。结果显示,D/F12比DMEM能促进细胞的增殖(p<0.05);细胞在高糖DMEM的转染效率显著高于D/F12(p<0.05);2株胎儿成纤维细胞(1雄1雌)获得5株稳定表达的细胞,其中4株来源于雌性细胞。结果证明细胞培养基、性别和细胞系影响牛A-FABP转基因效率。

牛胎儿成纤维细胞的分离培养

研究了牛胎儿组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征,并对培养细胞的冷冻保存和复苏进行了观察。采取组织块培养法进行原代培养,在接种第5天到第6天成纤维细胞生长旺盛;用0.25%胰蛋白酶消化,传代培养细胞生长状态良好;用液氮冷冻法保存传代细胞,解冻后持续传代至第12代仍生长良好,第8代细胞冻存前和复苏后的活率分别为97.0%和94.3%,无显著差异(P>0.05);分离纯化的胎牛成纤维细胞的生长曲线都正常;成功地建立了牛胎儿成纤维细胞系。该细胞可经多次传代培养和冷冻保存。

利用启动子缺陷型打靶载体敲除牛胎儿成纤维细胞中的Prnp

利用启动子捕获对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。敲除动物的Prnp可使其具有抵抗Prion病感染的能力。采用启动子捕获策略,构建了牛Prnp启动子缺陷型打靶载体BoPrneo,线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞BFF,用250μg/mL G418进行药物筛选,共得到99个药物抗性细胞克隆。对细胞克隆进行PCR、测序及Southern blotting鉴定,结果表明,其中的4个细胞克隆为中靶细胞,说明牛胎儿成纤维细胞中的Prnp一条等位基因被成功敲除。本研究为牛Prnp的敲除提供了一种简单、安全、有效的方法。

CMV启动子指导pDsRed2-1基因在牛胎儿成纤维细胞中的表达

目的:为了检测扩增所得CMV启动子能够指导下游基因序列表达,从而可以为构建其它真核表达载体提供实验基础和依据。方法:对pEGFP质粒上的CMV启动子进行扩增,并将其插入pDsRed2-1质粒红色荧光蛋白上游,构建pCMV-Red质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞,对其进行荧光检测。结果:质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞48h后,荧光激发细胞,发红色荧光。结论:扩增所得CMV启动子具有启动其下游基因表达的功能。pCMV-Red质粒可用于构建其它真核表达载体。

重组人gdnf乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究

为了制备重组人GDNF牛乳腺生物反应器,采用组织块贴壁法分离培养雌性牛胎儿成纤维细胞,连续继代培养75d,进行形态观察和染色体分析,在此基础上,转染带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双重筛选标记的重组人gdnf乳腺特异表达载体pNR-GDNF,G418筛选阳性抗性克隆,进行PCR法鉴定。结果表明,分离培养的牛胎儿成纤维细胞具有正常的形态、分裂增殖特性和染色体数目;目的基因已整合到转基因细胞的染色体上。

牛成纤维细胞的分离与体外培养

研究了牛胎儿和成年牛皮肤组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征。通过组织块贴壁培养和分离单细胞接种培养均能获得原代牛皮肤细胞。用2.5 g/L胰蛋白酶+1mmol/L EDTA和5 g/L胶原酶I联合消化牛皮肤组织较2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化,得到更多的单个细胞,两者之间差异极显著(P<0.01),但其死细胞比率却有较大升高;2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化牛胎儿组织得到的单细胞数显著高于皮肤组织消化后得到的细胞数(P<0.01),死细胞比率也高于同种酶消化的皮肤组织。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化贴壁细胞后死细胞率明显高于用0.5g/L胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA消化的细胞(P<0.05);培养24 h后细胞贴壁率前者要明显低于后者(P<0.05)。用0.5 g/L胰蛋白酶轻度消化混杂生长的成纤维细胞和上皮样细胞,经过反复贴壁传代2～3代,可得到较纯的成纤维细胞。