牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染。克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体。用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24h后观察荧光表达,48h后加入600μg.mL-1 G418,筛选1周,300μg.mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养。对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析。结果,转染24h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEG-FP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1 500bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体。说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性。可以作为核移植进行转基因克隆牛研究。

黄牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及电转染条件的优化

为了进一步优化黄牛胎儿皮肤成纤维细胞的电转染条件,试验采用组织块贴壁的方法培养黄牛胎儿皮肤成纤维细胞,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,进一步优化黄牛胎儿皮肤成纤维细胞电转染条件。通过控制电压(200～600 V)、脉冲时间、电击次数等电转染条件,采用不同的条件组合,用电穿孔法将质粒PEGFP-N1电转染培养的黄牛胎儿皮肤成纤维细胞,再通过荧光显微镜分析电转染效率。结果表明:最佳的电转染条件是电压为500 V,脉冲时间为2 ms,电击次数为4次。

多功能激光光电平台联合重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶治疗轻中度面部敏感性皮肤疗效观察

目的观察多功能激光光电平台联合重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶治疗轻中度面部敏感性皮肤的临床疗效及安全性。方法选取2021年1月至2022年2月安徽医科大学第二附属医院门诊就诊的30例轻中度面部敏感性皮肤的病人,按随机数字表法分为对照组15例、治疗组15例。对照组单独外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(贝复新),1天2次;治疗组在对照组基础上联合应用多功能激光光电平台(舒敏专家)的电磁波模块及U光模块(830 nm/590 nm),1周1次。疗程均为4周,同时在疗程结束后1个月进行随访。对治疗前后病人的皮肤敏感症状评分及生活质量评分进行比较。结果治疗4周后,治疗组总有效率为93.33%(14/15),对照组为53.33%(8/15),治疗组明显优于对照组(P<0.05)。治疗组治疗前敏感症状积分和生活质量评分分别为(21.33±3.15)分及(12.13±2.17)分,治疗4周后分别为(3.67±2.58)分及(3.53±1.19)分。对照组治疗前敏感症状积分和生活质量评分分别为(20.6±2.47)分及(12.27±2.05)分,治疗4周后分别为(7.47±2.13)分及(5.80±1.15)分。治疗组和对照组的皮肤敏感症状积分和生活质量评分均较前降低(P<0.05),治疗组总体改善程度优于对照组(P<0.05)。随访1个月,对照组的复发率[53.3%(8/15)]高于治疗组[13.3%(2/15)](P<0.05)。结论多功能激光光电平台联合重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶治疗轻中度面部敏感性皮肤能有效改善皮肤敏感症状和病人的生活质量,同时有效预防复发,且安全无不良反应。

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶联合蒙脱石散对婴幼儿尿布疹的疗效观察与研究

目的探究重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)凝胶联合蒙脱石散对婴幼儿尿布疹的临床效果。方法选取2019年12月至2020年6月赣南医学院第一附属医院收治的72例婴幼儿尿布疹患儿作为研究对象,按照随机数字表法分为对照组与实验组,每组36例。对照组给予rbFGF凝胶干预,实验组在对照组基础上联合蒙脱石散干预,比较两组干预效果、恢复情况、皮肤损伤程度、血清学指标及不良反应发生情况。结果实验组治疗总有效率为94.44%,高于对照组的72.22%,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后,两组皮肤发红、皮肤破裂面积及皮肤侵蚀程度评分均低于干预前,且实验组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组不良反应发生率为5.56%,低于对照组的25.00%差异有统计学意义(P<0.05)。实验组尿布疹消退时间、住院时间均短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后,两组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)水平均低于干预前,干扰素-γ(IFN-γ)水平高于干预前,且实验组TNF-α、IL-4、IL-10水平低于对照组,IFN-γ水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论rbFGF凝胶联合蒙脱石散应用于婴幼儿尿布疹的疗效显著,可减轻皮肤损伤程度,改善机体炎症反应,缩短尿布疹消退时间,且不良反应少,值得临床推广应用。

CMV启动子指导pDsRed2-1基因在牛胎儿成纤维细胞中的表达

目的:为了检测扩增所得CMV启动子能够指导下游基因序列表达,从而可以为构建其它真核表达载体提供实验基础和依据。方法:对pEGFP质粒上的CMV启动子进行扩增,并将其插入pDsRed2-1质粒红色荧光蛋白上游,构建pCMV-Red质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞,对其进行荧光检测。结果:质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞48h后,荧光激发细胞,发红色荧光。结论:扩增所得CMV启动子具有启动其下游基因表达的功能。pCMV-Red质粒可用于构建其它真核表达载体。

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染

为获得转基因克隆牛的供体细胞，采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞，经2～3次传代纯化，绘制生长曲线，分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征。分别采用800、900、1000V／cm和1、5、10、15和20ms的参数组合，将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞，经800μg／mLG418筛选2周，继续以300μg／mLG418扩大培养2～3代，取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明，体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛，体外传代20次后核型未发生改变；转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达，筛选后各组克隆形成数以900V／cm和5ms组最多；PCR检测得到了预期条带，说明目的基因已经成功导入。分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体，进行转基因克隆研究。

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。

秦川牛成纤维细胞的分离培养体系优化

为建立秦川牛体细胞分离培养体系,分别选用组织块培养法、胰酶-胶原酶消化法和胶原酶-胰酶消化法提取秦川牛耳缘成纤维细胞。结果表明:组织块培养法获取成纤维细胞所需周期长,组织块贴壁17 d后可获得原代成纤维细胞,而双酶消化法在原代细胞贴壁至9 d时便可进行传代纯化培养;与双酶消化法Ⅱ相比,双酶消化法I获得的原代成纤维细胞浓度1.24×10^(6)/mL显著高于双酶消化法Ⅱ(0.9×10^(6)/mL)(P<0.05);传代培养5 d后,细胞汇合度达到80%,取第三代成纤维细胞进行免疫荧光和流式细胞术鉴定,成纤维细胞纯度达到95%以上;纯化后的成纤维细胞培养至第3天,开始进入对数生长期,第8天时增殖速度下降进入平台期。因此,双酶消化法I(0.25%胰酶处理30 min,再用1%胶原酶处理60 min)为分离培养秦川牛耳缘成纤维细胞的最佳方法。

胎儿和成人皮肤及其创面愈合过程中碱性成纤维细胞生长因子的表达及意义

目的 探讨胎儿和成人皮肤及其创面愈合过程中碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)的表达及其意义。方法 将孕龄 2 0～ 2 4周胎儿皮肤移植至 BAL B/ C裸鼠背部皮下 ,皮片成活后制造创面 ,建立胎儿无瘢痕愈合动物模型 ,定期获取相应标本。对临床所取正常成人皮肤及创面愈合皮肤标本 ,采用免疫组织化学染色方法 ,观察 b FGF的表达情况。 结果 正常胎儿皮肤及创伤后胎儿皮肤中均未见明显的 b FGF阳性表达。正常成人皮肤中血管周围可见阳性表达 ;创伤后成人皮肤也可见阳性表达 ,尤其成纤维细胞和血管内皮细胞创伤后表达明显增强。高倍镜视野随机观察计数b FGF阳性表达细胞数 ,正常胎儿皮肤为 2 .1± 0 .1,创伤后 12小时 ,1、3天和 1周胎儿皮肤分别为 2 .2± 0 .1、2 .1± 0 .3、2 .1± 0 .3和 2 .0± 0 .1;正常成人皮肤为 2 3.2± 4 .2 ,创伤后成人皮肤为 4 0 .5± 3.6 ,胎儿正常皮肤和创伤皮肤 b FGF表达与正常成人皮肤和创伤后皮肤 b FGF表达比较 ,差异有统计学意义 (P<0 .0 1)。 结论 b FGF的阴性表达可能是胎儿皮肤无瘢痕愈合的重要原因之一。

小鼠胎儿和牛睾丸成纤维细胞的冷冻保存

研究了冷冻保护液、平衡时间、降温速度、解冻液以及解冻方式对冷冻小鼠胎儿成纤维细胞和牛睾丸成纤维细胞活力的影响。结果表明 ,对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻 ,冷冻液 ( 0 .4 %BSA) +1 .5mol/ L乙二醇 +0 .1 mol/ L蔗糖的 PBS液 )的冷冻效果优于冷冻液 ( 1 0 %的 NBS+1 0 %DMSO的 DMEM液 )。用冷冻液 对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻 ,平衡时间可从 2 .5h缩短到 0 .5h;冷冻细管降温速度 ( -6.8～ -3 7℃ )可以从 0 .6℃ / min提高到 1 .2℃ / min;诱发结晶可以省略。 3种解冻液解冻细胞活力排序为 :解冻液 ( 0 .4 %BSA+0 .1 mol/ L蔗糖的 PBS) >解冻液 ( 1 0 %NBS的 DMEM) >解冻液 ( PBS)。用冷冻液 对 MEF和 BTF细胞冷冻过程中 。

蒙古绵羊胎儿皮肤成纤维细胞分离培养与特性分析

本研究以蒙古绵羊胎儿为材料,进行了胎儿性别鉴定,结果显示为雄性。取其皮肤组织进行离体培养,对所获得的细胞进行纯化,筛选出成纤维细胞。通过形态观察发现,在10代以内,细胞形态良好,随着代数增加梭型细胞有拉长趋势,在第20代时梭形明显拉长,单位面积细胞数目大量减少;同时做了F5、F10代细胞的生长曲线,发现随着代数的增长,细胞生长力略有下降,但趋势不明显;对F5、F10代细胞做了核型分析,二倍体比率分别为85.71%和76.67%,这满足了作为核移植供体细胞的要求;细胞冻存后复苏贴壁情况良好。

碱性成纤维细胞生长因子及其受体在胎儿和成人皮肤内的表达特征及其意义

目的 :研究碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)和其受体 (b FGFR)以及磷酸化酪氨酸蛋白 (P Tyr)在胎儿和成人皮肤中的表达特征及其可能的生物学意义。方法 :16例被测标本中包括不同胎龄 (妊娠 12～ 31周 )的胎儿皮肤组织 8例和成人皮肤组织 8例 ,用免疫组织化学方法和病理技术确定 b FGF、b FGFR和 P Tyr这3种蛋白在胎儿和成人皮肤组织中的定位和表达量的变化规律。结果 :b FGF、b FGFR和 P Tyr在胎儿和成人皮肤内都有表达 ,b FGF主要分布于表皮细胞、成纤维细胞、毛囊上皮细胞和血管内皮细胞的胞浆和胞外基质中 ;b FGFR定位于这些细胞的细胞膜上 ;P Tyr蛋白的阳性信号在表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的质膜上和胞浆内都有分布。在胎儿发育初期 ,分别含有这 3种蛋白的阳性细胞数量很低 ;随着胎儿生长发育 ,这3种蛋白的阳性细胞率逐渐增大 ;在发育后期的胎儿和成人皮肤组织中 ,这 3种蛋白表达升高更加显著。结论 :b FGF、b FGFR和 P Tyr在不同发育阶段人的皮肤组织内呈阳性表达 ,显示它们可能对皮肤的发生、结构功能的维持以及伤后修复十分重要。在发育早期的胎儿皮肤中 ,这

培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响

采用单细胞培养法和组织块培养法从原代培养人胎儿成纤维细胞,并在不同体积分数胎牛血清(FBS)(0%、4%、8%、10%、12%)的条件下观察人胎儿成纤维细胞培养的状况并采用台盼蓝染色法进行活细胞计数.结果表明,早期由组织块培养法原代培养获取的细胞形态要比单细胞培养法原代培养获取的细胞稍好些,且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞.FBS对hFFs生长影响比较明显.在实际应用中,在体积分数8%FBS下,采用组织块培养法进行人胎儿成纤维细胞体外培养,效果良好.

牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养

本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻。

爪蟾卵母细胞抽提物可诱导牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程

应用非洲爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(Japanese Black cattle fetal fibroblasts,JBCFF),观察处理前后细胞的形态学变化,同时用免疫荧光染色法检测组蛋白的乙酰化状态和OCT4蛋白的表达,并对其多能性标志基因的mRNA表达水平进行定量分析。结果表明,与未处理细胞相比,经抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞组蛋白H3K9乙酰化程度与未处理组无显著差异;培养5~6d后细胞聚集形成'克隆簇'中碱性磷酸酶和Oct4蛋白染色阳性;同时也检测到Oct4和Nanog基因在其中的表达,而Sox2基因未见表达;且Oct4、Nanog基因表达量随处理后细胞培养时间的延长(4、5、6d)而呈依次上升趋势。可见,爪蟾卵母细胞抽提物能诱导和牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程,恢复其发育全能性,这对牛诱导性干细胞制备方法的探索和体细胞克隆及转基因克隆牛效率的提高具有一定的借鉴意义。

转乳铁蛋白肽和α干扰素基因的牛胎儿成纤维细胞的制备

旨在构建含有乳铁蛋白肽基因和α干扰素基因的载体,并制备转基因牛胎儿成纤维细胞,为研制抗乳房炎和口蹄疫转基因克隆牛提供供体细胞。本研究构建了由山羊β-酪蛋白启动子启动的牛乳铁蛋白肽基因和由CMV启动子调控的人α干扰素基因的载体,以EGFP基因作为报告基因,neo基因作为筛选基因;分别采用脂质体和电击法转染牛胎儿成纤维细胞,G418筛选得到转基因阳性细胞,并用PCR方法检测转基因细胞中目的基因的整合情况,用Western blotting检测α干扰素蛋白的表达。结果,得到了同时含有牛乳铁蛋白肽基因和人α干扰素基因的转基因牛胎儿成纤维细胞,并且α干扰素蛋白在转基因细胞中能有效表达。

固醇调节元件结合蛋白基因的过表达对促进牛胎儿成纤维细胞脂肪形成的影响

为了研究固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding factor 1,SREBP1)基因的表达与细胞脂肪形成的关系,本研究构建了pEGFP-C1-SREBP1重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-C1-SREBP1及pEGFP-C1空质粒转染至牛胎儿骨骼肌成纤维细胞培养48h,实时荧光定量PCR和Western blotting分析目标基因表达水平的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果发现,pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染细胞内SREBP1mRNA的表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);SREBP1蛋白也出现明显上调;空白对照组和pEGFP-C1阴性对照组细胞内均未见有红染细胞,而pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染组中出现了清晰的红染细胞。说明SREBP1的表达可促进牛胎儿骨骼肌成纤维细胞脂肪合成,证实牛胎儿成纤维细胞中SREBP1表达和脂滴形成之间存在直接关系。

敲减MC4R表达对牛胎儿成纤维细胞CMS系统关键因子的影响

为获得敲减黑素皮质素4受体(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因的牛胎儿成纤维细胞,并探讨其在能量平衡神经调节系统中的作用,将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体pGSH1-GFP-MC4R,利用阳离子脂质体转染牛胎儿成纤维细胞并使用G418筛选稳定转染细胞株.利用实时荧光定量和Western印迹检测MC4R及中枢黑素皮质素系统(central melanocortin system,CMS)关键因子的表达水平变化.结果表明,在稳定转染的牛胎儿成纤维细胞系中,MC4R表达显著抑制,瘦蛋白(leptin)和阿黑色素原(POMC)表达下调,黑素皮质素拮抗物agouti相关蛋白(AGRP)和MC3R表达上调,而神经肽Y(NPY)表达无明显改变.综上所述,本研究成功获得了敲减MC4R基因表达的牛胎儿成纤维细胞.相关基因表达水平检测结果提示,MC4R的表达水平对CMS系统中的各关键基因的表达有不同的抑制或促进影响.