BHV-1在牛胚气管细胞中的增殖规律研究

为研究牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)在牛胚气管细胞(EBTr)中的生长特性和增殖规律,参考文献设计合成特异性引物和探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法,检测BHV-1感染EBTr细胞6、12、24、48、72、96、120、144h后病毒的增殖规律,并观察对应时间点的细胞病变(CPE)。结果显示,用100TCID_(50)的BHV-1感染EBTr细胞,48h后开始出现细胞病变,72h细胞病变明显,120h细胞大部分变圆,开始脱落,144h细胞大面积脱落、崩解。实时荧光定量PCR检测结果表明,BHV-1感染EBTr在6h^24h内,病毒缓慢增殖,48h^96h,病毒增殖速度加快,拷贝数呈对数增长,120h^144h,BHV-1的含量仍然呈现升高的趋势,但增长速度变慢。结果证明,BHV-1能够在EBTr中产生CPE,而且CPE程度与病毒DNA增殖规律一致,该结果可以为深入研究BHV-1对EBTr细胞的致病机理提供基础资料。

牛胚胎移植系列讲座——第一讲 胚胎移植的意义

胚胎移植(embryo transfer,ET)也称受精卵移植.它的简单含义就是将一头母畜(供体)的受精卵或早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来,移植到另一头母畜(受体)的输卵管或子宫内,使之继续发育为与供体动物具有相同基因型的后代,俗称为"借腹怀胎".

牛疱疹病毒Ⅰ型感染对牛胚气管细胞Toll样受体2表达的影响

为研究牛疱疹病毒Ⅰ型(BH V-1)对体外非免疫细胞——牛胚气管细胞(EBTr)表达Toll样受体2(TL R 2)的影响,了解TLR2在BHV-1感染时介导的天然免疫反应机制,本试验将EBTr细胞分为BHV-1感染组和对照组,分别收集培养后第6、12、18、24及48小时的细胞总RN A和总蛋白,通过荧光定量PCR和W estern-blot技术,检测感染BHV-1后TLR2在基因和蛋白水平的动态变化。结果显示,在第6和12小时,感染组TLR2 m RNA和蛋白的相对表达量均低于对照组;在第48小时,感染组TLR2 m RNA和蛋白的相对表达量均显著高于对照组(P<0.01)。结果表明,BHV-1感染EBTr细胞会影响TLR2 m RNA和蛋白的表达,提示TLR2参与宿主细胞对BHV-1的识别,触发天然免疫,这为探索BHV-1感染的免疫机制提供了依据。

不同培养基对牛体外受精胚发育率及抗冻性的影响

采用M199、SOFaa(aa:Amino Acid)和SOF对牛体外受精卵进行发育培养,比较了三种培养条件下的囊胚发育率、孵化率以及这三种条件下培养出来的囊胚的抗冻能力。在M199和SOFaa处理组,囊胚发育率分别为22.6％和29.0％,孵化率分别为 11.3％和8.1％,两者间无显著差异,但均极显著高于SOF处理组(13.6％,0,P<0.01)。三个处理组的囊胚经冷冻解冻后的存活率分别为78.5％、46.4％和17.3％,孵化率分别为41.9％、23.2％和0,三者间存在极显著差异(P < 0.01)。结果表明,不同的培养液不但影响胚胎发育率,同时也影响胚胎的抗冻能力,M199的培养效果优于SOF,氨基酸能明显提高胚胎发育率及抗冻能力。

牛体外受精胚的玻璃化保存及细胞遗传学研究

用 2 5 %的乙二醇和 0 .2mol/L蔗糖与 2 5 %乙二醇混合的玻璃化溶液对牛体外受精的早期囊胚用 1步法冷冻保存 ,融解后 ,在D -PBS液 (含有 0 .5mol蔗糖 )中 15min除去冷冻保护剂 ,培养 48和 96h。结果表明 :用含有 0 .2mol的蔗糖和 2 5 %的乙二醇混合的玻璃化溶液保存的早期囊胚的生存力明显高于不含蔗糖的玻璃化溶液 (P <0 .0 0 1)。染色体分析结果表明 :含有蔗糖的玻璃化溶液保存的囊胚的卵裂细胞数明显高于单独使用 2 5 %乙醇保存的囊胚 (P <0 .0 5 )。染色体异常发生率无明显变化。

牛体外受精低品质胚胎冷冻保存效果

体外受精胚的品质和耐冻性较体内受精胚差、妊娠率低 ,特别是低品质冻胚的妊娠率更低。为了改善低品质冻胚的妊娠率 ,我们设 10 %乙二醇 (EG)、 8%EG和 5%EG +5 % 1,2 丙二醇 (PD) 3种不同处理的防冻剂就牛体外受精低品质胚胎的冷冻效果进行了初步的探讨。结果用这 3种防冻剂冷冻保存的胚胎 ,解冻后用TCM - 199+10 %犊牛血清 (FCS) +10 0 μmol/Lβ 巯基乙醇 (β ME)培养 72h的孵化率分别为 11 1%、 2 1 4 %和 2 0 6 % 。

奶牛半胚裸露冷冻保存试验报告

本试验研究了不同冷冻方法、半胚冷冻前不同培养时间及不同冷冻保护液对奶牛７日龄半胚裸露冷冻效果的影响。结果以１０％（Ｖ／Ｖ）甘油＋１０％（Ｗ／Ｖ）葡聚糖（Ｔ－５００）＋０．１Ｍ蔗糖／２０％ＦＣＳ－ＰＢＳ溶液为冷冻保护液，裸露冷冻冻前培养１．０小时的半胚，获得了８２．４％（１４／１７）的较高存活率。试验结果表明，半胚冷冻前培养时间及不同保护液对奶牛半胚裸露冷冻有显著影响。

热激损伤对牛孤雌激活胚胎后续发育的影响

为了研究早期胚胎核与胞质对热激的应激反应,以及产生应激后二者之间的相互作用对胚胎体外发育、合子期激活基因的表达及胚胎细胞凋亡的影响。本研究将孤雌激活胚随机分为2组分别于38.5或41℃培养7h;随后将二者核进行置换,使用正常培养的胚胎与热激胚胎进行核置换,分别构建热激核-正常胞质重构胚以及热激胞质-正常核重构胚,检测了核质置换胚胎的体外发育率、合子激活基因的表达和胚胎凋亡情况。结果,当正常核移入41℃热激的卵胞质,重构胚的发育率显著下降;热激后的核质置换胚胎中存在合子基因激活不完全的现象,这种情况主要存在于热激胞质-正常核重构胚中;热激能诱导胚胎发生细胞凋亡,早期胚胎的胞质对热激更敏感,并在后期的诱导凋亡中起到主导作用。这些结果表明,虽然热激对核和胞质都有损伤,但胞质对热激损伤更为敏感。早期胚胎受到热激后导致发育能力降低的易感性主要是由胞质所引起的;早期胚胎受到热激可能会损伤到卵胞质中的母源因子,即使与正常核构成重构胚也依然会导致合子基因表达异常;并且胞质受到热激损伤会在热激诱导的凋亡机制中起到比核更大的作用。

从融解后的牛冻胚中除去冷冻保护剂(甘油、1.2—丙二醇)试验

一般情况下,人们多采用将浓度由高到低递次转换的方法,即分步消除法(Whitting ham 1971; Wilmut and Rowson, 1973; Bilton and Moore, 1976)与向细胞内添加非渗透性物质—蔗糖二步法(Niemann,1982)以及一步细管法(Leibo, 1983; Renard等, 1983; Suzuki等, 1983)来除去冷冻保护剂。

运用遗传工程培育奶牛和菜牛

为使农民饲养更多健壮的奶牛和菜牛,科学家们运用遗传工程提高母牛产犊率。他们挑选最好的公牛和母牛进行交配,然后从母牛体内取出受精卵,在显微镜下将其切割成片,每个小片以后就会发育成一个牛胚,而且每个牛胚都相似。再将这些牛胚分别植入普通母牛体内,让它们继续发育。这些牛出生后都具有其双亲的优良性状,而不会象它们的生母。通常。

不同生物型BVDV感染对MDBK细胞类泛素基因转录水平的影响

探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对牛胚肾细胞(MDBK)类泛素基因转录水平的影响。对致细胞病变型(cp型)BVDV标准株NADL毒株及非致细胞病变型(ncp型)BVDV分离株shz 132毒株进行增殖,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应测定2种病毒拷贝数,按照Reed-Muench法测定BVDV NADL病毒TCID50值。以100TCID50BVDV NADL病毒和同等拷贝数的BVDV shz 132病毒分别感染MDBK细胞不同时间(4、12、24、48h)后收集细胞,提取细胞总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板,采用特异性引物,通过RT-qPCR反应检测细胞类泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9的转录水平。结果显示,致细胞病变型BVDV NADL感染MDBK细胞48h,引起细胞显著的病变,而非致细胞病变型BVDV shz 132感染不引起细胞病变。BVDV NADL和shz 132的病毒拷贝数分别是1.13×1011 copies/mL和1.77×1011 copies/mL,BVDV NADL的TCID50是10-4.9 TCID50/0.1mL。RT-qPCR分析显示,与对照组相比,2种BVDV病毒感染都能引起MDBK细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9基因的相对表达量变化。在BVDV shz 132感染的细胞中,SUMO1、SUMO2、SUMO3的相对表达量在各个感染时间都高于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,以上3个基因的相对表达量下调,差异极显著(P<0.01);而Ubc9基因的相对表达量则低于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,其相对表达量上调,差异极显著(P<0.01)。结果表明,BVDV感染调控了MDBK细胞SUMO系统,提示细胞SUMO系统参与了BVDV在胞内的活动,且这种调控作用与病毒的生物型存在密切联系。