转bFat-1基因载体及牛胚胎成纤维转基因细胞系构建

为了获取转bFat-1基因牛胎儿成纤维细胞系,试验采用酶切连接方法构建pIRES2-eGFP-bFat-1载体,采用脂质体转染、G418筛选、荧光显微镜观察、基因组PCR和RT-PCR鉴定方法构建重组转bFat-1基因牛胚胎成纤维细胞。结果表明:SacⅠ和ApaⅠ双酶切和测序验证pIRES2-eGFP-bFat-1载体构建正确;经脂质体转染,G418筛选去除未转染细胞,最后通过荧光显微镜观察,基因组PCR和RT-PCR鉴定获得了4株既高表达绿色荧光蛋白又高表达bFat-1基因的牛胚胎成纤维转基因细胞株。说明已成功构建了转bFat-1基因载体并构建出转基因细胞系。

2种饲养层对牛iPSCs从始发态向初始态转化的影响

饲养层细胞对获得多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)非常重要,小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)已被广泛用作培养和产生多种胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)及诱导PSCs(induced PSCs,iPSCs)的饲养层,但由于种间差异,MEF可能不适于家畜ESCs和iPSCs。研究表明,PSCs可被分为至少2种多能性状态:初始态(naive state)和始发态(primed state)。本室前期用MEF饲养层从牛睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)获得了牛的始发态iPSCs。本研究基于初始态培养液(na6ve medium,NM),比较了MEF饲养层和牛胚胎成纤维细胞(bovine embryonic fibroblasts,BEF)饲养层对牛iPSCs多能性和形态维持及其从始发态向初始态样转化的影响。结果显示,MEF+NM(MNM)和BEF+NM(BNM)均能在3~4 d内将牛iPSCs从始发态转化为初始样状态。克隆分析显示,BNM培养中牛iPSCs的克隆数、碱性磷酸酶活性和转化效率均高于MNM培养中的指标。这些克隆在长期培养中均能表达初始态iPSCs的多能性分子标记。结果表明,采用NM条件,在MEF和BEF饲养层上均可产生牛初始态样iPSCs,但在BEF上转化效率较高。