化学致癌物-MNNG对培养牛胰管上皮作用的研究

以化学致癌物-MNNG对长期培养的牛胰管上皮的作用进行观察。光镜和透射电镜下观察结果,牛胰管上皮出现粘液细胞、复层、结节状、乳头样和异型增生,上皮下腺管不规则增生。增生细胞以核和核仁的异型性变化为特点,并观察到早期癌样病变。

维生素A对MNNG诱发的器官培养牛胰管上皮癌变过程的抑制作用

应用化学致癌物MNNG作用于体外培养牛胰管上皮,8周时,电镜下观察牛胰管上皮在形态学上发生了明显的异型增生和早期癌样改变;而加入维生素A组上皮细胞仍保持单层柱状上皮。如先加入MNNG培养4周,造成牛胰管上皮细胞的明显增生,停用MNNG,加维生素A继续培养4周,发现可遏制并逆转增生的复层细胞,使之基本恢复为单层柱状上皮;而未加维生素A的相应对照组却出现了癌样增生。本实验从不同方面证实了维生素A在实验性胰腺癌中的化学预防作用,为维生素A在胰腺癌防治领域中的应用奠定了实验基础。

重金属离子对牛胰核糖核酸酶的作用机理

通过在核糖核酸酶介质中加入Ce3 +,Cd2 +,Pb2 +,研究其对核糖核酸酶活性影响的作用机理。结果表明低浓度重金属离子对酶活性有激活作用 ,高浓度则严重抑制酶活性。荧光滴定表明在一个RNase分子上结合一个Ce3 +、或三个Cd2 +、或三个Pb2 +,因而导致了酶的构象改变 。

聚乙二醇修饰牛胰核糖核酸酶

采用N 羟基珀酰亚胺活化酯法活化单甲氧基聚乙二醇 ,测定了聚乙二醇 (PEG)的活化度为86 2 %。以活化的PEG对牛胰核糖核酸酶进行化学修饰 ;分析了蛋白质被修饰程度。用毛细管电泳法给出了被修饰蛋白的修饰度与修饰蛋白分布的定量结果。比较了被修饰产物对大分子底物 (酵母RNA)与小分子底物 (2’ ,3’ 环磷酸胞嘧啶 )的降解活力 ,其表观酶活力分别保留了 5 2 8%和 66 3 %。

牛胰多肽与脂作用时插膜状态的研究

利用单层膜和荧光技术，研究牛胰多肽（ＢＰＰ）和磷脂单分子层及脂质体的相互作用。ＢＰＰ与磷脂单分子层作用的动力学曲线以及临界插膜压表明它和磷脂，尤其是酸性磷脂有较强的相互作用；荧光研究表明，与脂作用后多肽内源性荧光光谱峰位蓝移，说明发荧光的酪氨酸残基存在由亲水环境向疏水环境的转变。荧光猝灭实验表明多肽与脂作用后，其内源性酪氨酸残基荧光更不容易被碘盐所猝灭，提示酪氨酸残基受到了脂双层的屏蔽作用；

牛胰多肽（BPP）二级结构的红外光谱和圆二色谱分析

牛胰多肽（ｂｏｖｉｎｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＢＰＰ）是胰脏分泌的一种含有３６个氨基酸的多肽［１］，ＢＰＰ能预防和治疗由胆酸盐诱发的大鼠急性胰腺炎，具有细胞保护作用。本文用傅里叶变换红外光谱（ＦＴ－ＩＲ）和圆二色谱（ＣＤ），对ＢＰＰ在水溶液中的二级结构进行了研究。两种方法的分析结果互相补充，进一步确定了ＢＰＰ在溶液状态的二级结构。本研究为进一步探讨ＢＰＰ抑制膜融合的机理打下了基础。

牛胰多肽(BPP)与DPPC脂质体相互作用的付立叶变换红外光谱研究

本文详细报导用付立叶变换红外光谱法研究去氧胆盐(DOC)和牛胰多肽(BPP)与DPPC脂质体的相互作用.发现DOC和脂质作作用后,DPPC的CH:对称和反对称伸展振动频率向高波数方向移动,相交曲线变宽,相变温度降低;BPP和DPPC作用后,红外光谱无明显变化,但它却能抑制由DOC对DPPC脂质体的上述作用.从而对BPP具有细胞保护作用的分子机制作了进一步的阐述.

牛胰多肽与CL／PC脂质体作用后二级结构的变化

用傅立叶变换红外光谱（ＦＴ－ＩＲ）研究了ＢＰＰ与膜作用后其二级结构的变化。通过对红外光谱中酰胺Ｉ谱带进行解卷积、微分双曲线拟合等处理，结果表明，ＢＰＰ与脂膜作用后，其二级结构中α－螺旋成分增多，无规卷曲成分减少。

牛胰多肽（BPP）抑制CL／PC脂质体的膜融合

Ｃａ２＋能诱发ＣＬ／ＰＣ脂质体的聚集，漏出及进一步的融合。其作用大小随着Ｃａ２＋浓度的增高而增强。吸收、荧光和冷冻断裂电镜等方法所得结果证明了这一点。ＢＰＰ抑制由Ｃａ２＋诱发的ＣＬ／ＰＣ脂质体的聚集和融合，其作用的大小随ＢＰＰ的增加而增大。上述三种方法从不同角度都给出了同样结果，肯定了ＢＰＰ抑制ＣＬ／ＰＣ脂质体由Ｃａ２＋诱发的聚集和融合作用。

双激活剂牛胰酶壳聚糖絮凝法制备工艺优化

采用Plackett-Burman设计对影响胰酶活力和提取率的13个因素进行筛选,有效筛选出主效因素(P<0.05):壳聚糖、CaCl2、胰腺与十二指肠配比和激活pH值。在此基础上,再运用均匀设计对以上4个显著因素的最佳水平范围进行研究,通过偏最小二乘法建立回归方程求解得到胰酶制备最适条件为壳聚糖用量0.17%、CaCl2用量0.06%、胰腺与十二指肠配比8.26:1、激活pH5.37。此条件下验证实测值胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶活力和胰酶提取率分别为3408.71U/g、33.11kU/g、23.93kU/g和13.22%,与理论预测值的相对误差分别为7.15%、8.56%、10.63%、1.93%。Plackett-Burman设计和均匀设计相结合的方法在双激活剂胰酶壳聚糖絮凝法制备工艺中具有可行性。

利用共振镜生物传感器研究牛胰脱氧核糖核酸酶Ⅰ与DNA的相互作用

利用IAsys共振镜生物传感器研究了牛胰脱氧核糖核酸酶Ⅰ(Bp DNase Ⅰ)与DNA的相互作用.求出了不同温度下,Bp DNase Ⅰ与DNA相互作用的结合和解离的动力学速率常数(Kass,Kdiss)和平衡常数(KA,KD),并且计算出了该过程的热力学参数(ΔH和TΔS).在298 K时该结合过程的KA=(3.521 2±0.232 4)×105(mol/L)-1,KD=(2. 852 4±0. 188 3)×10-6 mol/L,TΔS 为(84. 860±3. 712) kJ/mol,该结合过程的ΔH 为(53.222±3.548) kJ/mol,是一个熵驱动的过程.本文还对Mg2+浓度对Bp DNase Ⅰ与DNA的相互作用的影响进行了研究.在相同温度下,Bp DNase Ⅰ与DNA的结合作用在有Mg2+存在时较无Mg2+ 存在时高约30.5 倍,表明Mg2+能极大地提高Bp DNase Ⅰ与DNA的结合能力.

牛胰脏RNA Ⅱ的制备

目的：改进从牛胰脏制备RNAⅡ的方法，以降低成本，减少污染排放，提高产品的质量和收率。方法：采用酶-苯酚-氯仿稀盐法，替代传统方法的大剂量苯酚多次萃取法从牛胰脏提取RNAⅡ。结果：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法制备的RNAⅡ，制剂A260／A230、A260／A280的比值分别达到2．1和1．9以上，传统工艺为1．44和1．63；DNA含量控制在2％以下，传统工艺为6．2％；有机试剂消耗降低明显，由传统工艺的18000mL苯酚·kg^-1牛胰脏降低到600和300mL氯仿·kg^-1牛胰脏；成本由原来的253元·g^1牛胰脏核糖核酸降到11～14元·g^1牛胰脏核糖核酸。结论：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法制备的RNAⅡ中蛋白、多糖含量较低，纯度较传统方法有较大提高；该方法可减少有机试剂用量，减少污染排放，使生产成本大幅度下降；本工艺适合大规模生产RNAⅡ。

牛血清白蛋白对牛胰脂肪酶交联酶聚体制备及催化性能的影响

研究了牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)对牛胰脂肪酶交联酶聚体(Lipase-CLEAs)制备及其催化性能的影响。获得的优化制备条件为:BSA的添加质量浓度为0.05 g/L,用1%戊二醛交联2 h。在此条件下制备的固定化酶最大酶活回收率为70%,比不添加BSA制备的Lipase-CLEAs提高了15%。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度被提高了10℃,同时,添加BSA制备的Lipase-CLEAs的温度稳定性、p H和储存稳定性比游离酶和Lipase-CLEAs都有较大提高。在重复使用8次后,添加BSA制备的Lipase-CLEAs仍能保持初始酶活的80%,但未添加BSA制备的CLEAs只保留了30%的初始酶活。

牛胰脏组织蛋白酶L的纯化和酶学性质

新鲜牛胰脏匀浆物经酸化粗提后,再通过盐析、柱层析等步骤纯化,制备了0.58 mg纯酶,纯化倍数达530.54。经凝胶电泳分析,该酶有2个亚基,分子质量为29.1 k D和18.9 k D。牛胰脏组织蛋白酶L的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为6.5。巯基还原剂二硫苏糖醇、L-半胱氨酸均明显激活了该酶活性,10μmol/L的N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)可完全抑制其活性。1 mmol/L的Zn2+对酶活性有明显抑制作用。该纯化酶可水解苄氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-MCA),其Km值为3.52μmol/L。

精氨酸对牛胰核糖核酸酶氧化复性的时相性抑制作用

精氨酸常在重组蛋白的体外复性中,作为一种小分子添加剂用于抑制蛋白聚集。精氨酸对蛋白复性折叠过程本身的影响尚不清楚。首次以不易聚集的牛胰核糖核酸酶为研究对象,通过飞行质谱检测氧化复性中间体的变化,通过酶学活性检测蛋白活性的恢复过程,观察了精氨酸对氧化复性的直接影响。发现不同浓度精氨酸对牛胰核糖核酸酶的氧化复性有直接的抑制作用。特别在0.5 mol/L浓度时,精氨酸对牛胰核糖核酸酶氧化复性的抑制作用具有独特的时相依赖性:早期复性可持续至4 h,其活性恢复达30%后,晚期复性基本终止。这种抑制特征与脲的抑制作用有明显的不同,精氨酸没有完全抑制关键结构中间体的形成。结果说明,牛胰核糖核酸酶的氧化复性,除经关键结构中间体的主要通路外,还可能存在一个潜在复性通路,它是其氧化复性后期的关键限速通路。该复性通路可以被0.5 mol/L精氨酸完全阻断。

毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶A的响应面法优化

采用Central Composite Design(CCD)实验设计及响应面分析相结合的方法,对毕赤酵母表达牛胰脏羧肽酶A的表达条件进行优化,旨在获得牛胰脏羧肽酶A的最佳表达条件。单因素实验结果显示,诱导时间为96 h时,最佳甲醇含量为0.5%、最佳p H值为4、诱导时最佳菌体OD600值为7。在此基础上,利用CCD实验设计及响应面分析法进行回归分析,获得最优表达参数为:甲醇含量0.5%、诱导pH为5.90、接种前种子培养基OD600为6.54。在优化后的条件下进行验证实验,得到牛胰脏羧肽酶A的表达量为0.325 mg/m L,与理论值(0.326 mg/m L)相比,相对误差较小,为0.38%。同时,对表达产物进行了Western Blot鉴定。研究表明,采用响应面法分析优化牛胰脏羧肽酶A的表达条件准确可靠,有助于找出最佳条件,为指导其在发酵罐中进行高密度发酵生产牛胰脏羧肽酶A奠定基础。

牛胰多肽不影响胆囊收缩素或促胰液素等诱导的大鼠离体胰腺泡淀粉酶分泌

实验结果表明,牛胰多肽(BPP)对基础及由八肽胆囊收缩素,促胰液素或血管活性肠肽所诱导的大鼠离体胰腺泡淀粉酶的分泌无明显影响,此外,BPP也不影响由八肽胆囊收缩素诱导的胰腺泡^(45)Ca的释放、以及由促胰液素或血管活性肠肽引起的细胞内cAMP的聚集,提示BPP在整体情况下抑制胆囊收缩素或促胰液素刺激胰酶分泌的作用不是通过在胰腺泡细胞受体水平直接抑制上述激素的促分泌作用来实现的。

牛胰核糖核酸酶结晶的制备

牛胰核糖核酸酶(E.C 2.7.7.16)首先由Kunitz用硫酸铵分级盐析的方法获得结晶,然而在多次重结晶后仍含有微量蛋白水解酶的活性。McDonald利用加热的方法除去这些掺杂的蛋白质后,得到了无蛋白水解酶活力的纯牛胰核糖核酸酶结晶。随后,Hirs等将结晶RNase在IRC-50(XE-64)的树脂上层析分离,分出A及B二个组分,比例为10:1。Taborsky将结晶RNase在CM-纤维素上层析,得到一个主峰和三个小峰,都具有酶活力,主峰相当于RNase A。

沉淀剂类型对蛋白质晶体分子堆积的影响

以不对称单位只有一个分子的牛胰核糖核酸酶和T4溶菌酶晶体为材料,着重研究了无机盐、有机溶剂和PEG三类不同的沉淀剂对晶体分子堆积的影响。经研究发现两种蛋白质中用无机盐做沉淀剂的晶型几乎都含有面积较大的二次轴对称接触面和较少的相邻分子数,同时其含有的参与接触的非极性残基集中分布于二次轴对称接触面,而盐键则在二次轴对称接触面上分布稀少。用有机溶剂作沉淀剂的晶型却含有面积较小的非二次轴对称接触面和较多的相邻分子数,而参与接触的非极性残基和盐键在各个非二次轴对称接触面上随机分布。用PEG作沉淀剂的晶型其分子堆积特征总体上类似于用有机溶剂作沉淀剂的晶型,但个别晶型具有与用无机盐做沉淀剂的晶型相似的分子堆积特征。以上结果提示,用三类沉淀剂得到的不同的分子堆积特征可能与三类沉淀剂不同的诱导结晶机理密切相关。