重组牛胰蛋白酶抑制剂对小鼠急性肝损伤的保护作用

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对小鼠急性肝损伤的保护作用。方法小鼠60只随机分成6组:正常对照组、模型组、rBPTI的3个剂量组(分别为3、6、12×104kIU·kg-1)、抑肽酶组(6×104kIU·kg-1)。每天腹腔注射给药,7d后体外注射CCl4建立小鼠急性肝损伤模型。末次给药后眼眶取血测定小鼠血清ALT、AST活性,观察肝脏组织病理改变。结果各剂量rBPTI可不同程度降低小鼠血清ALT、AST活性,降低肝组织MDA含量,与模型组比较差异有统计学意义(P<0·05、P<0·01),同时不同程度减轻肝组织病理损伤。结论rBPTI对体外CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用,作用效果同天然BPTI相当。

表面活性剂吐温与牛胰蛋白酶作用研究

通过紫外和荧光光谱法研究了吐温与牛胰蛋白酶作用的性质,用滴定法研究了吐温对牛胰蛋白酶活性的影响,研究表明:吐温与牛胰蛋白酶的相互作用能改变芳香族氨基酸残基在空间结构中所处的微环境,使色氨酸残基所处环境的疏水性增强;吐温对牛牛胰蛋白酶荧光猝灭效应是静态猝灭,牛胰蛋白酶内部的酪氨酸和色氨酸残基与吐温发生的能量转移作用较小,主要是牛胰蛋白酶与吐温形成复合物所引起的;吐温与牛胰蛋白酶的主要表现为疏水作用力;吐温对牛胰蛋白酶活性的影响较少。

重组牛胰蛋白酶抑制剂对大鼠急性胰腺炎的治疗作用

目的:观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)的治疗作用。方法:取大鼠60只,随机分成6组:假手术组、模型组、rBPTI的3个剂量组、抑肽酶组。注射牛磺胆酸钠建立大鼠ANP模型,股静脉注射给药48h后,测定大鼠血清和组织淀粉酶和脂肪酶含量,观察胰腺组织病理变化。结果:rBPTI治疗组可明显降低血清和组织淀粉酶、脂肪酶的浓度,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),且使胰腺的病理变化减轻。结论:rBPTI对牛磺胆酸钠诱导大鼠ANP具有治疗作用,作用效果同天然BPTI相当。

牛胰蛋白酶抑制剂研究进展

牛胰蛋白酶抑制剂具用广泛的蛋白酶抑制活性,在机体中参与凝血、纤溶、细胞迁移、细胞分化、调亡和炎症反应等,在临床上应用于细胞调亡、凝血、骨质疏松和肿瘤等的治疗。本文综述了牛胰蛋白酶抑制剂的分子结构和功能及生物学特性,牛胰蛋白酶抑制剂的临床应用及对脏器保护的应用等进行探讨。

环己烷中牛胰蛋白酶与正戊胺复合物的晶体结构

丝氨酸蛋白酶是有机溶媒中研究酶促反应的主要对象之一 .其中的胰蛋白酶在生物体内有重要的作用 ,对其抑制剂如苯甲脒衍生物的研究可应用于治疗很多疾病 .在水溶液中包括正戊胺在内的开链脂肪胺类小分子对胰蛋白酶的抑制能力有限 ,不能生成复合物 .我们对浸泡在含有正戊胺的环己烷中的β 牛胰蛋白酶的晶体结构进行了测定 ,分辨率为 0 .2nm ,并与水相中同样处理的晶体作了比较 .结果表明 ,正戊胺于环己烷中和 β 牛胰蛋白酶有强结合作用 ,一个戊胺分子结合到酶活性中心 ;另一个结合在 β 牛胰蛋白酶的表面 ,与也被结合的硫酸根形成氢键 .此X射线蛋白质晶体结构分析提供了一个例子 ,在有机溶剂中可用弱抑制剂的探针小分子研究其和蛋白的结合情况 ,以及描绘蛋白质表面的结合位点 .这些研究可以为搜索弱抑制剂提供有用的结构信息 .

原花青素B_(2)同牛胰蛋白酶的相互作用分析

采用荧光猝灭法对原花青素B_(2)与牛胰蛋白酶之间的相互作用进行研究,同时利用分子模拟方法研究二者之间的相互作用机理。实验结果表明,原花青素B_(2)可以有效地猝灭牛胰蛋白酶的荧光发射,二者之间可以形成1∶1型复合物。分子对接结果表明,原花青素B_(2)对接在牛胰蛋白酶表面的一个疏水口袋中,并与His57,Val213,Trp215等残基间存在疏水作用,与His57,Asn97,Ser190,Ser214,Gly216,Tyr228等残基间存在氢键作用。所形成的牛胰蛋白酶/原花青素B_(2)复合物具有较强的分子动力学稳定性,复合物在30 ns时间内结构稳定,主客体均方根差(RMSD)均变化很小。

光谱法结合分子对接模拟技术研究头孢他啶与胰蛋白酶的相互作用机理

本文主要通过荧光光谱法与分子对接技术研究了在298,303,310 K温度下头孢他啶(CFD)与胰蛋白酶(TRP)之间的作用机制。研究结果表明,CFD与TRP之间是通过1∶1的静态猝灭方式相互作用。依照双对数方程处理荧光猝灭数据得到了CFD与TRP作用的结合常数Ka和结合位点数n。通过热力学方程求得了不同温度下CFD与TRP作用的热力学参数。实验数据表明,它们之间的作用力主要是疏水作用和氢键作用,这与分子对接技术所得的结果是一致的。

重组人Ⅱ型胰蛋白酶的性质及初步应用研究

目的研究重组人Ⅱ型胰蛋白酶的性质及初步应用。方法用米氏方程和双倒数作图法确定米氏常数Km,Vmax值,BAEE法测定胰蛋白酶活性,将胰蛋白酶用于激活羧肽酶原B及细胞消化。结果重组人Ⅱ型胰蛋白酶最适反应温度30℃,最适pH 7.6,以BAEE为底物,Km和Vmax分别为12.7μmol/L和212.76μmol/min。EDTA与PMSF抑制酶活性,高于50℃条件下易失活。与牛胰蛋白酶相比,重组人胰蛋白酶对羧肽酶原B有更高的激活效率,细胞消化方面二者效果基本相同。结论温度及pH是影响酶稳定性的较大因素,重组人胰蛋白酶可替代牛胰蛋白酶用于激活羧肽酶原B和细胞消化。

白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达

目的:探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法:将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti,电击转化毕赤酵母菌株X-33,用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果:转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI;培养上清中rBPTI含量约200 mg.L-1;SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508;rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致;胰蛋白酶活性抑制分析结果表明,抑制常数Ki=(2.6±0.1)×10-9,与天然BPTI一致。结论:hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg.L-1。

rhKD/APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化

目的:构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体(rhKD/APPvar)的毕氏酵母工程菌,建立适合大规模发酵、纯化rhKD/APPvar的工艺。方法:利用已构建的rhKD/APP表达质粒,在其活性中心两侧设计2个酶切位点(ApaⅠ和SacⅡ),实现人KD/APP活性中心RAM与BPTI活性中心KAR的替换,构建rhKD/APPvar表达质粒。将重组质粒转化到酵母菌X-33中,优化rhKD/APPvar表达最佳pH值,使rhKD/APPvar获得高效表达。利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。结果:酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD/APPvar-pPICZαC重组质粒。经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌X-33中。SDS-PAGE分析,甲醇诱导表达后在相对分子质量约6 700处出现蛋白条带,pH 6.0、甲醇诱导120h蛋白表达水平最高,经纯化获得纯度达95%的重组蛋白。结论:成功构建KD/APPvar-pPICZαC重组质粒,经毕赤酵母表达和纯化获得了rhKD/APPvar蛋白。

PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中引导分泌表达天然N-端rBPTI

目的:在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达天然N-端rBPTI。方法:将PHOⅠ/bpti基因克隆到真核表达载体pPICZα,电转化毕赤酵母菌株X-33。结果:构建了含PHOⅠ/bpti基因的表达质粒,并在X-33中分泌表达rBPTI。用胰蛋白酶抑制实验筛选出表达rBPTI的工程菌。表达上清经阳离子交换层析分离纯化为单一组份,SDS-PAGE显示相对分子质量为6 500。结论:PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中成功地诱导分泌表达了具有正确N-端氨基酸序列的rBPTI。

琼脂糖凝胶提取纯化抑肽酶的研究

采用琼脂糖凝胶为载体,共价偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,将其用于亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶。通过实验研究,计算抑肽酶抑制比活单位(BAEE单位/mg胰蛋白酶)为79000,酶活性回收率76.63%。该工艺具有操作简便、收率高、产品质量好、污染低等优点,适于工业化,有一定的工业应用前景。