奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响

【目的】探讨奶牛脂肪间充质干细胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells,bAD-MSCs)对氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力的影响。【方法】使用0、5、25、50、100、200μmol/L H_(2)O_(2)处理奶牛子宫内膜上皮细胞2、4、6、8、12 h后,通过MTT试验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平来筛选H_(2)O_(2)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的最佳条件。在细胞划痕试验中设立对照组、H_(2)O_(2)组、bAD-MSCs共培养组(1∶0.5)、bAD-MSCs共培养组(1∶1)、奶牛乳腺上皮细胞(MACT)共培养组(1∶0.5)和MACT共培养组(1∶1)共6组,分析奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力,并利用Western blotting检测细胞外蛋白调节激酶(Erk)和磷酸化细胞外蛋白调节激酶(pErk)蛋白的表达水平。【结果】MTT试验结果显示,4~12 h内50μmol/L H_(2)O_(2)组细胞存活率为50%~80%,适用于构建氧化应激模型。流式细胞术结果显示,用50μmol/L H_(2)O_(2)刺激奶牛子宫内膜上皮细胞2 h时,ROS水平显著高于对照组与4、6、8、12 h组(P<0.05)。划痕试验结果显示,与对照组相比,H_(2)O_(2)组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组相比,bAD-MSCs共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力均显著增加(P<0.05),MACT共培养组细胞迁移能力均显著降低(P<0.05)。Western blotting结果显示,与对照组相比,H_(2)O_(2)组奶牛子宫内膜上皮细胞中pErk蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组相比,bAD-MSCs共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞中pErk蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),MACT共培养组细胞中pErk蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。【结论】50μmol/L H_(2)O_(2)处理2 h可成功构建奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型,bAD-MSCs可促进氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移并参与调控Erk蛋白的表达。

脂肪间充质干细胞对奶牛蹄叶炎的疗效

本试验对患蹄叶炎的奶牛通过蹄部注射牛脂肪间充质干细胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells,bAD-MSCs)制剂进行疗效观察。将原代bAD-MSCs复苏传代并收集细胞与上清液,进行细胞超声破碎浓缩制作成bAD-MSCs制剂;利用小鼠和家兔对bAD-MSCs制剂进行安全性试验,然后对奶牛进行临床治疗试验,通过监测奶牛的体温、呼吸数以及跛行评分变化等评价其临床疗效。bAd-MSCs制剂对小鼠体重与主要脏器无影响(P>0.05);家兔体温升高均低于0.6℃,并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃。在奶牛在体试验中,治疗组与对照组相比,试验前后的呼吸数与体温变化无显著差异(P>0.05)。但在跛行程度上,给药6 h后治疗组奶牛的跛行程度开始变轻(表现出治疗效果),在注射后48 h奶牛的跛行评分在治疗组和对照组分别是3.25±0.25和4.5±0.29,治疗效果明显(P<0.05);而在注射后(14 d)奶牛的跛行评分在治疗组和对照组分别是1.75±0.25和4.75±0.25,其治疗效果表现出极显著差异(P<0.001)。结果表明:bAD-MSCs制剂是无毒性、无热原性和无刺激性的制剂,患病奶牛在注射该制剂后48 h显著地降低了跛行评分,对奶牛蹄叶炎具有较好的治疗效果。本试验为防治奶牛蹄叶炎提供了新的研究方向。