牛膝多肽促大鼠海马神经元突起的生长

目的研究牛膝多肽(ABPP)对体外培养的大鼠海马神经元突起生长的促进作用及其对生长相关蛋-白43(GAP-43)和神经丝蛋白(NF-H)mRNA和蛋白表达的影响。方法以体外原代培养的胎鼠海马神经元为研究模型,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测ABPP对海马神经元细胞活性的影响,通过免疫荧光细胞化学法,采用Image-Pro Express软件测量不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h,对海马神经元神经突起生长的影响;通过实时荧光定量PCR法定量分析不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药6h,对海马神经元GAP-43和NF-H基因表达的影响;采用免疫印迹法观察不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h后,对海马神经元GAP-43和NF-H蛋白表达的影响。同时应用胞外信号调节激酶(ERK)特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养海马神经元,分析ABPP对海马神经元的作用与ERK通路的关系。结果ABPP可有效地促进海马神经元突起的生长,加药后24h浓度为1.0mg/L,作用最强;实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光细胞化学法和免疫印迹检测的结果表明,ABPP能增加体外培养的海马神经元GAP-43和NF-H的mRNA和蛋白表达,PD98059可抑制该过程。结论ABPP能促进体外培养的海马神经元神经突起的生长,其作用与上调GAP-43和NF-H基因的表达相关,并可能与ERK通路有关。

牛膝多肽通过抑制氧化应激减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤

目的探讨牛膝多肽(ABPP)预处理对心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤的影响及其机制。方法建立大鼠MI/R模型,将成年SD大鼠随机分为Sham(假手术)组、MI/R组、药物预处理(ABPP+MI/R)组。检测血流动力学、用氯化三苯基四氮唑和伊文思蓝双染法检测心肌梗死(MI)面积、以血浆肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测心肌损伤情况、以超氧化物、丙二醛(MAD)和超氧化物歧化酶(SOD)含量检测心肌氧化应激以及Western blot方法测定心肌组织中gp91^(phox)的表达。用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡指数(AI),荧光分析法检测caspase 3活性。结果与MI/R组比较,ABPP预处理使左心室上升、下降最大速率(±LVd P/dtmax)升高(P<0.05),MI面积显著减少〔MI/R组为(36.0±3.0)%,ABPP组为(26.5±3.5)%,P<0.05〕,血浆CK和LDH水平分别降低到(1251±72)U/L和(1961±122)U/L(P<0.05),TUNEL阳性染色显著降低(P<0.05),caspase-3的活性增加(P<0.05),超氧化物蓄积减少(P<0.05),显着降低了gp91phox的表达(P<0.05),MDA的含量显著减少(P<0.05),SOD活性增加(P<0.05)。结论 ABPP降低氧化应激和对MI/R损伤的心肌具有保护作用。

牛膝多肽可能通过ERK1/2途径诱导PC12细胞向神经元分化

目的:研究牛膝多肽(ABPP)诱导PC12细胞向神经元分化的作用,初步探讨ABPP作用于PC12细胞的信号转导途径。方法:以体外培养的PC12细胞为研究模型,观察在低血清的情况下不同浓度ABPP(0.25、0.50、1.00μg/ml)诱导PC12细胞发生的形态学改变。采用免疫荧光细胞化学法,观察神经丝蛋白(NF-H)在ABPP诱导分化的PC12细胞中的表达;采用Western blot法观察ABPP(1.0μg/ml)加药后不同时间段(0、6、12h和1、2、3、7d)和不同浓度ABPP(0.25、0.50、1.00μg/ml)加药2 d后对PC12细胞ERK1/2活性的影响,同时应用ERK1/2特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养PC12细胞,分析ABPP对PC12细胞的作用与ERK1/2通路的关系。结果:ABPP处理3 d后,部分PC12细胞开始出现神经元样的形态。随着加药时间延长具有神经元样的细胞逐渐增多,到7 d时,可以见到神经生长因子(NGF)和ABPP处理组PC12细胞的突起都显著增多,能形成网络;14 d时,这种现象愈发显著。加药后7 d和14 d,ABPP各浓度组的细胞分化率以及细胞突起长度均明显提高,且存在明显的剂量反应关系。加药第7天和第14天,ABPP高剂量组与NGF组的PC12细胞均出现NF-H标记阳性的分化细胞。ABPP对ERK1/2的激活作用存在明显的量效关系,以1.0μg/ml作用2 d为最大。当用PD98059抑制ERK1/2的活化时,ABPP对ERK1/2的激活作用被部分阻断。结论:ABPP具有诱导PC12细胞神经元性分化的作用,此作用可能是通过ERK1/2信号转导途径实现的。

牛膝多肽对局灶性脑缺血大鼠坐骨神经功能指数的影响

目的:观察牛膝多肽对局灶性脑缺血后大鼠坐骨神经功能损伤的影响,为其应用于临床提供实验依据。方法:制备局灶性脑缺血-大脑中动脉阻塞模型,血管阻塞再通后连续6 d进行尾静脉注射牛膝多肽。术后7、30 d进行足迹实验,观察牛膝多肽对局灶性脑缺血后坐骨神经功能下降的影响。结果:于大脑中动脉阻塞后7、30 d,SD大鼠坐骨神经功能指数的百分率明显增加(P<0.01)。尾静脉注射不同剂量的牛膝多肽后,坐骨神经功能指数百分率均有不同程度的下降,其中牛膝多肽中剂量组(ABPP(0.2 mg/kg)),无论是大脑中动脉阻塞后7 d还是30 d,其坐骨神经功能指数百分率均较生理盐水组明显下降(P<0.01)。结论:牛膝多肽对大脑中动脉阻塞引起的坐骨神经功能下降具有保护作用。

牛膝多肽对体外培养的MPP^+诱导的大鼠多巴胺能神经元凋亡的保护作用

目的:观察牛膝多肽(achyranthes bidentatapolypeptides,ABPP)对MPP^+(1-甲基-4-苯基-吡啶离子)损伤多巴胺能神经元的保护作用。方法:原代培养大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元,与浓度50 ng/ml的ABPP或50ng/ml神经生长因子(NGF)共同孵育6 h,加入20μmol/L MPP^+损伤多巴胺能神经元12 h。使用四甲基偶氮唑盐(methyl thiaaolyl terazolium salt color imetry,MTT)比色法测定细胞活力;采用末端标记技术(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。结果:ABPP或NGF预处理6 h可增强多巴胺能神经元的细胞活力,抑制MPP^+损伤后多巴胺能神经元的凋亡,上调Bcl-2/Bax蛋白的表达水平。ABPP对大鼠多巴胺能神经元的保护作用优于NGF。结论:与NGF相比,ABPP发挥了更好的拮抗MPP^+对多巴胺能神经元损伤的作用,其机制可能与上调Bcl-2/Bax蛋白的表达水平相关。

牛膝多肽活性成分对大鼠短暂性脑缺血的保护作用

目的:研究牛膝多肽(Achyranthes Bidentata polypeptides,ABPP)活性成分(active component k isolated from ABPP,ABPPk)对大鼠短暂性脑缺血的保护作用。方法:体外建立原代胎鼠皮层神经元氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)损伤模型,复氧复糖同时分别加入不同质量浓度ABPPk(0.04,0.2,1.0μg/m L)和ABPP(1.0μg/m L,阳性对照)处理皮层神经元,72 h后通过MTT法检测ABPPk对OGD损伤神经元活力的影响;通过Western Blot分析ABPPk对OGD损伤凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3表达的影响。体内建立大鼠短暂性大脑中动脉栓塞(transient middle cerebral artery occlusion,t-MCAO)模型,缺血2 h后再灌注同时经尾静脉注射给予1.0 mg/kg ABPPk,1次/d,连续3 d。于再灌注72 h行神经行为学评分,评价ABPPk对t-MCAO大鼠神经行为缺陷的影响;再灌注72 h断头取脑,行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色评价ABPPk对t-MCAO大鼠脑梗死体积的影响;再灌注72 h采用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)介导的dUTP生物素缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)试剂盒检测ABPPk对大鼠脑缺血半影区神经元凋亡的影响。结果:ABPPk在体外可有效拮抗OGD引起的皮层神经元凋亡,体内可显著减小脑梗死体积,防止神经元凋亡。结论:ABPPk对大鼠短暂性脑缺血具有神经保护作用,可为开发新型小分子活性肽类神经保护药物提供新的策略。

牛膝多肽对NMDA诱导的大鼠原代视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的:探讨牛膝多肽(ABPP)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的体外培养大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)损伤的保护作用。方法:采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养,随机分为对照组、NMDA组、ABPP+NMDA组[按ABPP不同药物质量浓度(0.1、0.3、1.0、3.0μg/ml)设4个亚组]和地西平(MK-801)+NMDA组。采用倒置显微镜观察细胞形态;抗Thy-1.1细胞免疫荧光染色鉴定培养细胞中RGCs纯度;MTT比色法测定细胞存活率;Hoechst/PI双染色法定性观察细胞凋亡;流式细胞术AnnexinV/PI双染色法定量测定细胞凋亡率。结果:NMDA可诱导大鼠视网膜神经节细胞凋亡,与NMDA组比较,0.3μg/ml ABPP可提高RGCs存活率,减少细胞凋亡(P<0.05)。结论:ABPP可抑制NMDA诱导的视网膜神经节细胞凋亡,保护视网膜神经元。

牛膝多肽对NMDA诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的:观察牛膝多肽(ABPP)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的转基因视网膜神经节细胞RGC-5细胞株损伤的保护作用。方法:在体外培养的RGC-5中加入不同浓度的牛膝多肽(0.05、0.5、5.0μg/ml)预保护12小时,用NMDA(100μmol/L)诱导细胞损伤,同时设正常对照组、单纯损伤组和地卓西平(MK-801)对照组,倒置显微镜下观察细胞形态;MTT比色法测定细胞存活率;Hochest染色检测细胞凋亡。结果:NMDA可诱导RGC-5损伤,与单纯损伤组比较,0.5和5.0μg/ml ABPP可提高RGC-5存活率,减少细胞凋亡(P<0.05)。结论:ABPP可抑制NMDA诱导的视网膜神经节细胞凋亡,保护视网膜神经元。

牛膝多肽活性成分联合tPA治疗对大鼠缺血性卒中亚急性期和慢性期的作用

目的:研究牛膝多肽活性成分(Achyranthes bidentata polypeptide k,ABPPk)联合组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)治疗对大鼠缺血性卒中亚急性期和慢性期的作用。方法:建立大鼠血栓性大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,分为4组:假手术组、生理盐水组、延迟的tPA单独治疗组、ABPPk+tPA联合治疗组。于缺血后6 h、1 d、3 d、7 d行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS),缺血后7 d亚急性期行生存率分析,行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色评价脑梗死和脑水肿体积,行荧光葡聚糖染料静脉灌注评价脑微血管通畅率,行CollagenⅣ免疫荧光化学染色评价血脑屏障完整性;于缺血后42 d慢性期行Morris水迷宫实验评价大鼠学习记忆能力。结果:ABPPk与tPA联合治疗缺血性卒中,可有效延长tPA治疗时间窗,延长缺血性卒中亚急性期生存率,改善其神经行为学评分,改善脑微血管通畅率,维持血脑屏障完整性,改善慢性期学习记忆能力。结论:ABPPk可作为tPA辅助治疗药物,联合用于治疗缺血性卒中。

牛膝多肽对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)介导的视网膜光感受器细胞损伤的保护作用

目的探讨牛膝多肽(ABPP)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)介导的光感受器细胞损伤的保护作用,并初步探讨ABPP保护作用的可能机制。方法在培养的光感受器细胞RGC-5中加入不同浓度的ABPP(0.05 mg·L^(-1)、0.10 mg·L^(-1)、0.50 mg·L^(-1)、1.00 mg·L^(-1)、5.00 mg·L^(-1))作用10 h后,通过NMDA(0.1 mmol·L^(-1))介导细胞损伤,同时设立NMDA组、正常组和地卓西平(MK-801)组。倒显微镜下观察各组细胞形态变化;MTT法检测细胞生存率;利用Hoechst 33258/PI双染和流式细胞仪测定细胞凋亡;钙离子成像观察细胞内钙离子变化;实时荧光定量PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的变化。结果NMDA组RGC-5细胞生存率较正常组明显下降(P<0.01);与NMDA组比较,0.10 mg·L^(-1)ABPP组、0.50 mg·L^(-1) ABPP组和1.00 mg·L^(-1) ABPP组RGC-5细胞生存率升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);MK-801组细胞生存率也明显高于NMDA组(P<0.05),与0.50 mg·L^(-1)ABPP组比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此,在后续的实验中选择0.50 mg·L^(-1)为ABPP组的有效药物浓度。正常组、ABPP组、MK-801组细胞凋亡率与NMDA组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ABPP组、MK-801组细胞内钙离子荧光强度与NMDA组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示,与NMDA组比较,正常组、ABPP组、MK-801组细胞内Bcl-2 mRNA表达均增加,Bax mRNA表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论ABPP可抑制NMDA介导的视网膜光感受器细胞损伤,作用呈一定的浓度依赖性,其机制可能与抑制钙内流以及上调Bcl-2 mRNA表达、下调Bax mRNA的表达有关。

ABPPk对施万细胞血清剥夺损伤的保护作用机制研究

目的:探讨牛膝多肽k(Achyranthes bidentata polypeptides k,ABPPk)对血清剥夺引起的施万细胞凋亡的保护作用机制。方法:通过转录组测序及生物信息学方法分析ABPPk对施万细胞血清剥夺损伤的保护作用机制。结果:转录组测序及生物信息学分析结果显示,ABPPk组主要参与正向调节粒细胞分化、Rho蛋白信号转导、肌动蛋白细胞骨架、细胞增殖、蛋白质泛素化等生物学过程,Rhog、Pak2、Yes1、Mef2c、Dock7等基因参与其中;神经生长因子(nerve growth factor,NGF)组主要参与囊泡介导的运输、胞吞作用、细胞形态调节、钙离子稳态调节等生物学过程,Kalrn、Mapk6、Sgk1、Cdc42bpb、Cnot6等基因参与其中。结论:ABPPk和NGF对施万细胞血清剥夺的保护作用机制有所不同,主要调控分子也不同。