葛根素、大黄素对糖基化产物引起的牛视网膜微血管周细胞损伤的影响

应用MTT比色测定细胞活性的方法 ,观察药物对AGE形成的影响以及药物对AGE引起的牛视网膜微血管周细胞损伤的影响。结果葛根素及大黄素与BSA共孵后形成的糖基化产物对周细胞的损伤较不给药组有不同程度的减轻作用 ,终浓度为10mM效应最大 ,提示药物可能在孵育时抑制了AGE的形成 ;细胞培养基中直接加入葛根素 (1,10mM )能对AGE引起的周细胞损伤起一定的保护作用。

中药黄芪对牛视网膜微血管周细胞增生的影响

目的 探讨中药黄芪对牛视网膜周细胞 (PC)增生的影响。方法 采用细胞计数结合噻唑蓝比色测定 ,研究PC在黄芪 (黄芪注射液 )培养下 ,PC增殖情况。结果 黄芪 1 0mg/mL、 2 0mg/mL、4 0mg/mL、 6 0mg/mL、 1 2 0mg/mL浓度组细胞增殖能力明显高于对照组 (P <0 .0 1 )。结论 黄芪注射液对牛视网膜周细胞生长具有促进作用 ,中等浓度的促进作用最为显著。

高糖诱导牛视网膜微血管周细胞FOXO1A表达增加

目的:探讨高糖培养牛视网膜微血管周细胞FOXO1A表达。方法:原代培养周细胞,用免疫细胞化学和Westernblot方法检测高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞FOXO1A蛋白表达。结果:视网膜微血管周细胞在5mmol/L D-葡萄糖培养72h后,FOXO1A免疫反应性主要表现在细胞核,在30mmol/L D-葡萄糖或5μ mol/LH2O2培养72h后,FOX-O1A免疫反应性显着增加,FOXO1A免疫反应性主要表现在细胞核和细胞质;Western blot发现高糖组和过氧化氢组周细胞培养48,72h后FOXO1A蛋白活性和表达较对照组显着增加。结论:高糖诱导的视网膜微血管周细胞FOXO1A表达和活性显著增加。

高糖对牛视网膜微血管周细胞P2X7及其下游活性氧簇、ATP产生和IL-6释放的影响

目的观察高糖对牛视网膜微血管周细胞(BRPs)P2X7及其下游活性氧簇(ROS)、ATP产生和IL-6释放的影响。方法将原代牛视网膜微血管周细胞分为4组:正常葡萄糖组(NG组,5.5 mmol/L葡萄糖),高糖组(HG组,30 mmol/L葡萄糖),NG+A438079组(P2X7受体拮抗剂A438079 HCl+5.5 mmol/L葡萄糖),HG+A438079组(P2X7受体拮抗剂A438079 HCl+30 mmol/L葡萄糖),分别检测P2X7受体的mRNA表达、蛋白表达水平及NG组和HG组加入P2X7受体激动剂前后ROS、ATP、IL-6的变化。结果高糖干预后,P2X7受体表达上调(P<0.05),ROS的产生、ATP消耗和IL-6释放均增多(P<0.05)。阻断P2X7后,ROS产生、ATP消耗和IL-6的释放显著减少(P<0.05)。结论高糖可经P2X7受体调节BRPs中ROS生成、ATP的产生和IL-6的释放。

葛根等中药对高糖作用下牛视网膜微血管周细胞增殖抑制的影响

目的 观察葛根等中药对高糖培养下牛视网膜微血管周细胞的保护作用。方法 采用MTT法测定葛根等对损伤牛视网膜微血管周细胞增殖的影响。结果 葛根 (1mg/mL)、胡黄连 (0 .1mg/mL)、知母(1mg/mL)及生地黄 (0 .1mg/mL)组MTT测定A值均较模型组增高。结论 葛根等中药能有效保护周细胞免受高糖所致的增殖抑制。

基于PI3K/AKT信号通路探讨益气养阴活血利水方抑制早期糖尿病视网膜病变大鼠微血管周细胞凋亡的作用机制

目的观察益气养阴活血利水方对早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜微血管周细胞中磷酸肌醇3-激酶蛋白(phosphatidylinositol 3-kiases,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phospho-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT)信号通路相关因子表达的影响,探讨益气养阴活血利水方抑制早期DR视网膜微血管周细胞凋亡的作用机制。方法138只雄性SPF级SD大鼠随机分成空白组(等体积蒸馏水),模型组,羟苯磺酸钙组[150 mg/(kg·d)],益气养阴活血利水方低剂量组[6.2 g/(kg·d)]、中剂量组[12.4 g/(kg·d)]、高剂量组[24.8 g/(kg·d)],每组23只。除空白组外,各组均采用链佐脲菌素腹腔注射并维持10周高血糖状态,诱导早期DR大鼠模型。造模成功后给药4周,取大鼠眼球进行检测。采用HE染色观察视网膜病理变化,采用TUNEL染色检测大鼠视网膜微血管周细胞凋亡,采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测PI3K、AKT、Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8,Caspase-8)、胱天蛋白酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3,Caspase-3)、细胞凋亡死亡激动剂BID蛋白(apoptotic death agonist BID protein,Bid)在视网膜微血管周细胞中的蛋白和mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠血糖显著升高(P<0.01),体质量显著降低(P<0.01),视网膜层次结构不清,各层细胞排列疏松,可见大量凋亡细胞,视网膜中PI3K、AKT mRNA表达水平下降(P<0.01),视网膜细胞凋亡数及Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,益气养阴活血利水方中剂量、高剂量组大鼠血糖均降低(P<0.01);羟苯磺酸钙组、益气养阴活血利水方各剂量组大鼠体质量均升高(P<0.01);益气养阴活血利水方各剂量组大鼠视网膜组织层次结构较清楚,细胞排列相对紧密,视网膜微血管周细胞凋亡数下降(P<0.05);益气养阴活血利水方高剂量组大鼠视网膜微血管周细胞中PI3K、AKT蛋白和mRNA表达水平均明显升高(P<0.01),Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid蛋白和mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)。结论益气养阴活血利水方可能通过调控PI3K/AKT信号通路,上调PI3K、AKT,下调Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid的表达,抑制早期DR大鼠视网膜微血管周细胞的凋亡,从而发挥其对早期DR视网膜微血管周细胞凋亡的保护作用。

高糖诱导大鼠视网膜微血管周细胞Ang-2/Tie-2系统表达改变及牛磺酸的防护效应研究

目的通过检测牛磺酸对高糖培养大鼠视网膜微血管周细胞(retinal microvascular pericytes,RMPs)中血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)/Tie-2系统表达的影响,探讨其防护糖尿病视损伤的机制。方法高糖培养大鼠RMPs,实验分正常对照组(Con,5mM D-glucose)、低剂量牛磺酸对照组(Con+0.1mM Tau)、中剂量牛磺酸对照组(Con+1mM Tau)、高剂量牛磺酸对照组(Con+10mM Tau)、甘露醇渗透对照组(Con+mannitol)、高糖组(HG,25mM D-glucose)、低剂量牛磺酸干预高糖组(HG+0.1mM Tau)、中剂量牛磺酸干预高糖组(HG+1mM Tau)、高剂量牛磺酸干预高糖组(HG+10mM Tau)、甘露醇高糖对照组(HG+mannitol)。用免疫细胞荧光双标鉴定大鼠RMPs,用荧光定量PCR技术和ELISA技术检测大鼠RMPs中Ang-2/Tie-2系统表达。结果高糖培养后,大鼠RMPs中Ang-2表达明显增加,Tie-2及磷酸化Tie-2明显降低,牛磺酸干预明显降低高糖组Ang-2表达,明显增加高糖组Tie-2及磷酸化Tie-2水平,呈剂量依赖关系。结论牛磺酸经调节Ang-2/Tie-2系统表达抑制糖尿病引起的视损伤。

共培养系统中视网膜微血管周细胞经KDR/Flk-1途径对内皮细胞增生的影响(英文)

目的:采用细胞共培养模型研究缺氧诱导视网膜新生血管生成过程中周细胞对微血管内皮细胞增生的作用及其相关血管内皮细胞生长因子受体2(KDR/Flk-1)调节机制。方法:免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管内皮细胞和周细胞,分别采用抗VIII因子、CD31抗体以及抗血小板源性生长因子受体β、结蛋白抗体免疫细胞化学法鉴定内皮细胞和周细胞。通过Millicell小室建立周细胞和内皮细胞共培养模型,使用MTT法和流式细胞仪检测内皮细胞增殖数量及周期,观察缺氧和常氧下周细胞对血管内皮细胞增生的影响,并采用RT-PCR法检测内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA水平变化,探讨相关调节机制。结果:经免疫细胞化学法鉴定,免疫磁珠法可获得高纯度的视网膜微血管内皮细胞和周细胞。MTT法显示,缺氧3～9d内皮细胞增生明显,6d增生达高峰(24.9%,P<0.01);共培养时内皮细胞的增生可被周细胞抑制。流式细胞仪检测发现,缺氧6dS期内皮细胞数量明显增加(43.9%,P<0.01);常氧(3.6%,P<0.05)或缺氧(15.1%,P<0.01)共培养时,周细胞均可抑制内皮细胞增生。缺氧下内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA水平是常氧下的1.3倍;常氧(45.1%,P<0.05)和缺氧(27.7%,P<0.05)共培养下,周细胞均可下调内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA表达。结论:缺氧和常氧共培养时周细胞均可抑制微血管内皮细胞增生,此抑制作用部分是通过下调内皮细胞KDR/Flk-1mRNA表达实现。

大鼠视网膜微血管周细胞的选择性培养

背景视网膜微血管周细胞（RMPs）在糖尿病视网膜病变（DR）等视网膜新生血管性疾病中的作用日益受到重视，并被视为潜在的治疗靶点。然而因组织材料来源受限及细胞分离纯化不易，RMPs体外研究工作的开展受到了限制。目的建立简便的大鼠RMPs分离、培养和纯化方法。方法摘取清洁级健康雄性SD大鼠的眼球，置于体积分数75％乙醇中浸泡1min，用眼科显微手术器械分离获取视网膜并将其剪成碎片，依次用2．5g／L胰蛋白酶和2g／LⅠ型胶原酶各消化15min，消化后分别过直径100μm和55μm滤网，收集视网膜消化后的微血管片段，用含有体积分数20％胎牛血清的低糖型DMEM接种于6孔板，至培养14～16d细胞达到80％～90％融合时进行消化传代，培养和传代期间通过换液法及差异消化法去除杂质细胞。用倒置相差显微镜观察细胞的形态和生长状态，用免疫荧光法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）、血小板源性生长因子受体-β（PDGFR—β）、von Willebrand因子（vWF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以鉴定RMPs。结果RMPs在接种后24—48h自微血管片段中迁移出，7d后形成中等大的细胞集落，14～16d后达到80％-90％融合状态。RMPs传代后生长速度加快，至12—14d达到融合。形态学鉴定显示，培养的细胞呈宽大、扁平、不规则形并伴多个突起的典型周细胞形态特征，且传代至第9代形态特征无明显变化。免疫荧光法检测显示，所培养的细胞均不表达内皮细胞特异性标志物vWF，约96％的细胞对周细胞标志物α—SMA或PDGFR—β抗体呈阳性反应，极少量细胞对胶质细胞特异性标志物GFAP抗体呈阳性表达。结论本实验成功建立了一种简单、经济的大鼠RMPs分离、纯化、培养方法，可以获得理想的高纯度RMPs。

人视网膜微血管周细胞原代培养及鉴定

目的:建立人视网膜微血管周细胞的培养方法并研究体外其免疫组化特征。方法:由人微血管片断生长出的周细胞首先通过其形态及生长方式进行鉴别,采用含有200mL/L胎牛血清的DMEM培养基于未包被培养瓶培养;非周细胞例如色素上皮细胞可机械除杂;周细胞特征性的标志物通过免疫组化和激光共聚焦显微镜评价。人视网膜微血管周细胞的生长曲线通过MTT法测定。结果:在这样的培养条件下,周细胞1～2d由微血管片断游出,1wk可形成较大克隆,大约2wk可融合成单层细胞。这些细胞为高度不规则形,重叠生长方式,没有接触抑制;表达α-平滑肌肌动蛋白,肌动蛋白以及3G5阳性;不含有von Willebrand因子和角蛋白;周细胞可部分混杂其他细胞,纯度为99%;周细胞可持续生长并传代。结论:本研究为首次报道人源性视网膜微血管周细胞的培养及鉴定。本培养实验为研究人眼异常血管疾病提供了新的平台。

牛视网膜微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的:探讨牛视网膜微血管内皮细胞(bovine retinal capillary endothelial cells,BREcs)体外分离、培养方法,为研究视网膜血管性疾病提供一定的实验基础。方法:无菌条件下取出视网膜并剪碎,经筛网过滤、胶原酶消化获取视网膜微血管内皮细胞,接种于明胶包被的培养瓶中,原代培养时用不同的培养基筛选细胞,并在传代时利用差速黏附法以获得较纯BRECs,通过形态学观察和免疫组化方法鉴定BRECs。结果:用此法原代培养BRECs纯度达98%,混有的血细胞及神经组织细胞碎片在换液和传代过程中逐渐被去除,成纤维细胞和周细胞的污染可分别用不同的培养基和差速黏附法纯化去除。结论:该方法简单有效,获得的BRECs纯度高,生长状态良好,为研究眼部血管性疾病提供良好平台。

牛视网膜微血管内皮细胞的培养和鉴定

牛视网膜微血管内皮细胞的培养和鉴定ＣＵＬＴＵＲＥＡＮＤＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮＯＦＢＯＶＩＮＥＲＥＴＩＮＡＬＣＡＰＩＬＬＡＲＹＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬＣＥＬＬ关键词内皮细胞微血管视网膜体外培养牛ＫｅｙｗｏｒｄｓＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ，...

牛视网膜微血管内皮细胞的培养及鉴定

目的探讨牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)的体外选择性培养和鉴定方法。方法采用含0.075%胶原酶和0.03%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)培养基选择性培养BREC。细胞鉴定采用经Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色细胞鉴定内皮细胞。结果通过选择性培养获得的BREC纯度达98%以上,并能连续稳定传代。BREC早期聚集在微血管碎片周围,呈片状鹅卵石样单层生长,存在接触性抑制。经Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色可见胞质内棕色的免疫沉积物反应呈阳性。结论本研究所采用的细胞培养方法可获得稳定生长与传代的较高纯度的视网膜微血管内皮细胞,简单、经济易操作。可为糖尿病视网膜病变等微血管病变研究提供可靠的(体外)试验方法。

高糖对牛视网膜微血管内皮细胞损伤的实验研究

目的 利用体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞来观测高浓度葡萄糖在细胞的损伤中所起的作用。方法体外培养牛视网膜微血管内皮细胞。通过MTT (四唑氮盐 )法及3 H -TDR掺入法研究高糖对牛视网膜微血管内皮细胞的损伤作用。结果 内皮细胞在含高糖 (2 8、 4 0mmol/L)DMEM培养基及不同培养时间 (2d、 7d)下MTT测定结果与对照组 (生理浓度葡萄糖 ,5 5mmol/L)比较有显著性差异P <0 0 5 ,3 H -TDR掺入法研究结果显示高糖对视网膜微血管内皮细胞的增殖有明显抑制作用 ,亦呈剂量及时间依赖性损伤细胞。

基于预孵法纯化培养小鼠原代视网膜微血管周细胞

目的建立简便的小鼠原代视网膜微血管周细胞(RMPs)分离、纯化、培养方法.方法在体视显微镜下机械分离获取小鼠视网膜,并碎化、胶原酶消化、过滤处理,收集视网膜碎片,预孵24h后用接种于含有体积分数20%胎牛血清的低糖型DMEM6孔板进行培养,并采用差异消化法纯化原代RMPs.通过倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光法鉴定周细胞标志物,周细胞/内皮细胞共培养系统鉴定周细胞的功能.结果经预孵的视网膜碎片再次孵育24h后,细胞开始从视网膜碎片中迁移出,逐渐增生形成大小不一的细胞集落.原代或子代细胞胞体呈不规则三角形,多个长突触,无接触性抑制.免疫荧光显示第3代细胞绝大部分α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)表达阳性,极少部分胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性,vonWillebrand因子(vWF)表达阴性,RMPs纯度达97%以上.体外培养的小鼠RMPs能被血管内皮细胞所募集,共同形成微血管样条索.结论本实验成功建立了一种简便的小鼠原代RMPs分离、纯化、培养方法,所培养的小鼠原代RMPs为功能性RMPs.

微血管周细胞与糖尿病视网膜病变中西医研究进展

大量的实验研究已经证实,微血管周细胞在糖尿病视网膜病变早期防治中扮演重要角色。为了观察和研究糖尿病视网膜病变早期微血管周细胞结构和功能变化,本文对近些年微血管周细胞的起源、形态分布、生理功能、细胞培养与鉴定、周细胞凋亡与糖尿病视网膜病变关系以及中医药防治糖尿病视网膜病变的研究进展进行综述,以期为糖尿病视网膜病变的周细胞研究及早期防治提供一种新思路。

微血管周细胞及其与糖尿病视网膜病变

概述了微血管周细胞的命名、定位、形态、常见标记物及来源;介绍了周细胞在微血管的生理、病理活动中所起的重要作用;总结了周细胞与糖尿病视网膜病变的相关性。深化对周细胞的认识是未来微血管疾病研究的方向,亦是挑战。

牛视网膜微血管内皮细胞的体外分离培养

目的探讨一种方便可靠的牛视网膜微血管内皮细胞(borein retinal microvas cular endothelial cell,BREC)体外培养方法。方法采用机械剪碎牛视网膜血管,用含牛血清、肝素、血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)的条件化培养基培养牛视网膜血管内皮细胞,观察细胞生长状况,制作生长曲线。应用 Von Willebrand 因子抗体免疫鉴定 BREC,并通过透射电镜观察 BREC 的超微结构。结果添加了 VEGF 的条件化培养基对 BREC 有很好的选择刺激作用,初期细胞呈鲤鱼样聚集在微血管碎片周围,对数生长期细胞似铺路石样大片单层生长,存在接触抑制。Von Willebrand 因子抗体染色阳性,获得 BREC 纯度在95%以上,能够连续传代。培养的细胞电镜下符合内皮细胞的特征。结论含 VEGF 培养基的应用可以获得高纯度、具有良好生长特性的 BREC,是一种简便、效果稳定可靠的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法。

周细胞对缺氧诱导下视网膜微血管内皮细胞增生的影响

目的探讨视网膜微血管内皮细胞(RMECs)与共培养的周细胞(PCs)及PCs条件培养液(PCM)对常氧和缺氧条件下RMECs增生的影响。方法传代培养大鼠RMECs和PCs,采用兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体和小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体免疫组织化学法鉴定RMECs,PCs采用小鼠抗大鼠desmin多克隆抗体和兔抗鼠抗血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)进行免疫荧光双标鉴定。Millicell小室建立PCs和RMECs共培养系统,PCs培养近融合期后制备PCM,向共培养系统或PCM中加入终浓度为200μmol/L的CoCl2诱导形成细胞化学缺氧模型,观察常氧和缺氧条件下PCs和PCM对RMECs增生的影响。使用MTT法、3H-TdR掺入法检测RMECs在不同培养条件下的增生数量,并用流式细胞仪检测RMECs在不同细胞周期的细胞率。结果近融合期的RMECs呈类纺锤状、单层生长,可见明显的接触抑制,Ⅷ因子和CD31均阳性表达。PCs形状不规则,细胞重叠生长无接触抑制,PDGFR-β和desmin抗体双标阳性。缺氧3～9d缺氧RMECs单独培养组较常氧RMECs单独培养组各时间点的RMECs均明显增生,缺氧6d时增生达高峰(P<0.01),细胞生长抑制率(GIR)为-24.9%。缺氧共培养组较缺氧RMECs单独培养组RMECs增生下降(P<0.05)。缺氧3、6、9d时常氧共培养组较常氧RMECs单独培养组RMECs数目均明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。缺氧6d时S期RMECs数量明显增加,占各期细胞总数的(43.9±0.8)%;常氧或缺氧共培养组,PCs均可抑制RMECs的增生,S期细胞分别占各期细胞总数的(3.6±0.1)%、(15.1±0.9)%(P<0.05,P<0.01)。常氧PCM组RMECs的吸光度(A)值和3H-TdR掺入量4～24h均低于对照组(P<0.05)。结论缺氧和常氧条件下RMECs和PCs共培养时PCs均可抑制RMECs的增生,常氧条件下PCM可抑制RMECs的增生。

基于内皮细胞/周细胞构建大鼠视网膜血管新生体外三维模型

目的:构建基于视网膜微血管内皮细胞(ECs)和周细胞(RMPs)的大鼠视网膜血管新生体外三维模型。方法:分离、纯化、培养大鼠视网膜微血管内皮细胞及视网膜微血管周细胞,选用第3~7代经鉴定后的细胞用于研究,采用细胞示踪剂对细胞进行染色,混合后按表面培养法接种于Matrigel,动态观察,并检测血管新生期间血管内皮生长因子A(VEGF-A)的表达。结果:培养12h时,RMPs被ECs招募,聚集成大小不等细胞团块;24h时,ECs/RMPs共同形成复杂的三维血管样条索网;48h时,网状结构出现明显崩解,仅保持少量不完整的简单网状结构;72h时,血管样条索网完全崩解。在三维模型发生过程中,VEGF-A的表达量升高;退化时,VEGF-A的表达量下降。结论:成功基于视网膜微血管全成分细胞ECs和RMPs构建了大鼠视网膜血管新生体外三维模型。