牛隐孢子虫病研究进展及综合防控策略

牛隐孢子虫病是牛感染隐孢子虫引起的一种寄生性原虫病,该病以腹泻、厌食为主要特征,严重的可导致动物死亡。牛隐孢子虫病随着规模化养殖业的发展已在全世界范围内广泛流行,并成为全球新生犊牛肠炎腹泻的最重要原因之一。因此,该病引起了国内外兽医工作者越来越多的关注。本文总结了近年来国内外学者对该病的研究进展以及防控策略,并从流行现状、防控措施及未来展望进行综述,以期提高相关人员对牛隐孢子虫病的认识,为该病的科学防控提供参考。

牛隐孢子虫病研究现状

牛隐孢子虫病是一种原生性寄生虫病,引起该病的病原主要寄生在牛的胃肠道,使患病牛出现严重腹泻。近些年,越来越多的科研工作者致力于牛隐孢子虫病的研究。本文总结国内外对牛感染隐孢子虫种类的各项研究,并从病原、流行病学和展望三方面进行综述,为进一步了解牛隐孢子虫病提供参考。

犊牛隐孢子虫病的流行病学与防控措施

1907年Tyzzer首次在家鼠身上发现隐孢子虫,随后在多种动物中也发现了该虫,1976年在美国首次发现人类感染隐孢子虫的病例,表明隐孢子虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病。隐孢子虫主要寄生于动物的肠道,并主要引起幼龄动物腹泻病。牛隐孢子虫病主要见于犊牛,导致犊牛出现严重腹泻甚至脱水症状,病情严重时可导致犊牛死亡。在我国内蒙古、北京、广东等省均有牛隐孢子虫病的报道,并且在规模化养殖场中犊牛感染隐孢子虫的情况较为严重,给我国肉牛和奶牛养殖均造成了严重的影响。本文对牛隐孢子虫病的病原特征、流行病学、临床症状和病理变化、诊断方法和防控措施进行综述,希望为犊牛隐孢子虫病的防控工作提供参考。

不同处理措施对牛粪样中隐孢子虫卵囊杀灭效果观察

取一例牛隐孢子虫阳性粪样分别采用1%甲醛溶液(A组)、1%二氯异氰脲酸钠溶液(B组)、2%烧碱溶液(C组)以及密封厌氧发酵(D组)处理,经5 d、10 d、15 d、20 d后分别取样采用蔗糖漂浮、涂片以及改良抗酸染色和镜检检查相应样本中隐孢子虫卵囊数量。结果A组4个时间节点卵囊数量分别为3.5枚、0.5枚、0枚、0枚;B组4个时间节点卵囊数量分别为1.75枚、0.25枚、0枚、0枚;C组4个时间节点卵囊数量分别为7.5枚、5.25枚、2.75枚、0.75枚;D组4个时间节点卵囊数量分别为9.75枚、6.50枚、4.75枚、3.00枚;而对照组4个时间节点卵囊数量分别为10.50枚、8.50枚、8.00枚、7.25枚。结果表明:4个试验组对牛隐孢子虫卵囊均有不同程度抑杀效果,其中B组效果相对较好。

18Sr RNA基因巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫分离株

目的18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(restriction fragment length polymor-phism,RFLP)鉴定上海(简称SH-BOV)和徐州(简称XZ-BOV)两株牛源隐孢子虫。方法改良-抗酸染色确定感染隐孢子虫的上海株和徐州株牛粪,提取DNA后经18S rRNA基因巢式PCR扩增,扩增产物测序后用Blast和MEGA软件进行同源性和系统发育分析。同时扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切,且XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后进行RFLP分析。结果通过18S rRNA基因分析,SH-BOV与1株巴西牛隐孢子虫Cryptospridiumbovis同源性为100%,种系发育树上两者在同一分支;XZ-BOV与安氏隐孢子虫C.andersoni同源性为99%,种系发育树上两者在同一分支。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切后,可鉴别出SH-BOV为C.bovis,XZ-BOV为C.andersoni或C.muris。XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后可鉴别出XZ-BOV为C.andersoni。结论上海株牛源隐孢子虫(SH-BOV)鉴定为牛隐孢子虫(C.bovis),徐州株牛源隐孢子虫(XZ-BOV)鉴定为安氏隐孢子虫(C.andersoni)。

牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定

目的用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫。方法改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小。以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18SrRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增目的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树。结果上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为(5.6±0.49)mm×(5.2±0.51)mm。扩增出的18SrRNA基因片段为812bp。上海牛源隐孢子虫分离株的18SrRNA与巴西的牛隐孢子虫(Cryptospridium bovis,GenBank登录号为151935628)序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。结论上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫(C.bovis)。

内蒙古某奶牛场两种致犊牛腹泻原虫的鉴定及遗传进化分析

为明确内蒙古某规模化奶牛养殖场腹泻犊牛寄生虫性病原的感染情况及其分子学特性,采集该养殖场18头发生腹泻犊牛的新鲜粪便样品。通过形态学方法并结合分子生物学方法对样品中隐孢子虫(Cryptosporidium)和蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)进行分离鉴定和感染情况统计分析。形态学检查结果表明,18份粪便样品中隐孢子虫感染率为5.56%(1/18),蓝氏贾第虫感染率为72.22%(13/18)。进一步对18份粪便样品提取DNA,并基于SSU rRNA和BG基因位点分别对隐孢子虫和蓝氏贾第虫进行PCR扩增、序列比对和遗传进化分析。电泳检测结果显示,显微镜检测阳性粪便样品均在830 bp和511 bp处出现目的扩增条带。同时,序列比对及遗传进化分析也表明,所分离到的隐孢子虫与来自于不同国家和地区的牛隐孢子虫(C.bovis)在SSU rRNA基因位点上具有100%序列同源性,因此被归于同一个进化分支,而所分离的蓝氏贾第虫在BG基因位点上与集聚体E参考分离株的序列同源性高达99.78%以上,提示其属于集聚体E。通过形态学和分子学方法明确了牛隐孢子虫和蓝氏贾第虫是该奶牛场主要致犊牛腹泻的寄生虫性病原,此结果可为该地区犊牛腹泻的防治提供理论依据。

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫。方法提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA。根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术的原理，设计4条隐孢子虫特异引物，利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA，以正常牛粪DNA为阴性对照。LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果，绿色判为阳性，棕色判为阴性，对LAMP产物进行电泳分析，观察其特征条带的情况。结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后呈绿色，阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色。隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带，阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物。结论LAMP方法敏感、特异、简便，可用于检测牛粪中的隐孢子虫。

保定地区奶牛源隐孢子虫的分离与基因鉴定

为了解保定地区奶牛源隐孢子虫感染情况,从当地3个奶牛场随机采集145份奶牛粪便经饱和蔗糖溶液漂浮后直接镜检和抗酸染色后镜检,阳性样品采用PCR方法扩增18S rRNA基因,同时将扩增出的目的片段进行克隆和序列分析,并将分离株与其他11个隐孢子虫参考株的18S rRNA序列进行比对和遗传距离比较。结果表明:有10份粪便样本为隐孢子虫阳性,感染率为6.9%(10/145),不同奶牛场、年龄段奶牛隐孢子虫感染率有显著性差异(P<0.05)。10份粪便样品采用PCR方法扩增后有7份为18S rRNA基因阳性,扩增出的18S rRNA部分基因片段长528 bp。保定地区隐孢子虫分离株扩增的基因序列与牛源隐孢子虫18S rRNA基因序列(Gen Bank登录号为HQ179571)同源性最高,确定保定地区分离到的奶牛源隐孢子虫为牛隐孢子虫。

深圳某引种奶牛场奶牛感染隐孢子虫的分子特征

目的了解深圳市某奶牛场引进育种奶牛的隐孢子虫感染情况及隐孢子虫分离株的分子特性。方法于2018年5月收集深圳市某奶牛场奶牛新鲜粪样,粪样分装后抽提隐孢子虫基因组DNA,巢式PCR扩增隐孢子虫小亚单位核糖体核糖核酸基因(SSU rDNA),阳性样品进行测序和BLAST比对分析,鉴定隐孢子虫基因型,并构建系统进化树。采用Graphad Prism7.0软件进行作图和卡方检验。结果共收集20头奶牛粪样,其中成年产乳牛粪样5份,断奶后犊牛粪样10份,断奶前犊牛粪样5份。检出隐孢子虫阳性8份,阳性率为40%;其中成年产乳牛隐孢子虫阳性1份(1/5),断奶后犊牛隐孢子虫阳性5份(5/10),断奶前犊牛隐孢子虫阳性2份(2/5)。测序分析鉴定出2个隐孢子虫基因型,芮氏隐孢子虫(n=5)和牛隐孢子虫(n=3),各年龄组中均有芮氏隐孢子虫感染。经与GenBank中隐孢子虫SSU rDNA基因型比对,5个芮氏隐孢子虫分离株中4个与埃塞俄比亚牛源芮氏隐孢子虫SSU rDNA基因(GenBank登录号为KT922233)序列相似度达100%,1个与华北地区牛源芮氏隐孢子虫SSU rDNA基因(GenBank登录号为HQ179574)序列相似度达99.9%;3个牛隐孢子虫分离株与埃塞俄比亚牛源牛隐孢子虫SSU rDNA基因(GenBank登录号为KT922231)的序列相似度达100%。基于SSU rDNA基因序列构建的隐孢子虫种系发育进化树,本研究获得的芮氏隐孢子虫序列与牛隐孢子虫分别在两群分支中,与不同地区的同一隐孢子虫虫种一致。结论深圳市某奶牛场奶牛感染隐孢子虫较为普遍,以芮氏隐孢子虫为优势感染虫种。

牛腹泻症的鉴别与预防

多种疾病都有腹泻症状,腹泻是各种类型肠炎的特征,某些侵害胃肠道并引起其发炎的传染病(如牛副结核病、牛病毒性腹泻病)和某些肠道寄生虫病(如牛球虫病、牛隐孢子虫病)及某些中毒病都会有腹泻症。笔者作为畜牧兽医技术人员,在工作中,经手了一例牛腹泻症的诊断与鉴别工作,现将2例病例的临床症状、诊断、鉴别、预防情况介绍如下。