【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分,其生长发育直接影响畜禽肉产量,叉头转录因子O1(forkhead box protein O1,FoxO1)作为重要的转录调控因子,其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用,...【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分,其生长发育直接影响畜禽肉产量,叉头转录因子O1(forkhead box protein O1,FoxO1)作为重要的转录调控因子,其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用,为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品,提取其RNA并反转录,利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞,通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒,以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达,其在成年牛的背脂中表达量最高,在背最长肌组织中表达量最低,且FoxO1在犊牛背最长肌组织中的表达量要极显著高于成年牛的(P<0.01)。亚细胞定位结果显示FoxO1在牛骨骼肌细胞的细胞核和细胞质内均有表达,其细胞核内荧光强度高于细胞质。成功构建FoxO1过表达载体,并完成FoxO1重组过表达腺病毒的包装与扩繁,在感染牛骨骼肌细胞后,能显著提高FoxO1表达水平(P<0.01)。EdU检测显示过表达FoxO1会显著降低细胞增殖率(P<0.01),流式细胞周期检测显示过表达FoxO1会显著增加G1期细胞数并减少S期和G2期细胞数,抑制细胞G1/S期的转化,并减少G2期细胞的形成。利用qPCR进一步检测发现,增殖相关基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2均极显著下调(P<0.01),促凋亡相关基因BAD和BAX显著上调以及抑凋亡基因BCL2显著下调(P<0.05)。过表达FoxO1导致牛骨骼肌细胞肌管形成量减少,qPCR检测结果发现,骨骼肌分化相关基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表达量显著下调(P<0.05)。【结论】FoxO1在牛的不同组织中均有表达,是一个广泛存在的转录调控因子,并且在背最长肌组织生长发育不同阶段存在表达差异,起到阶段调控作用。FoxO1在细胞核和细胞质中均发挥重要的转录调控作用,特别是在细胞核内。过表达FoxO1可能通过抑制细胞增殖相关基因和肌细胞分化相关基因的表达,从而抑制牛骨骼肌细胞的增殖与分化,并且可能通过上调促凋亡基因的表达和下调抑凋亡基因的表达来促使牛骨骼肌细胞凋亡的发生。展开更多
【目的】利用转录组测序(transcriptome sequencing,RNA-Seq)和全长翻译组测序(ribosome-nascent-chain-complex sequencing,RNC-Seq)分析比对转录和翻译两个不同水平上牛骨骼肌的生长发育过程,解析其发育特征和规律,并筛选出可能在转...【目的】利用转录组测序(transcriptome sequencing,RNA-Seq)和全长翻译组测序(ribosome-nascent-chain-complex sequencing,RNC-Seq)分析比对转录和翻译两个不同水平上牛骨骼肌的生长发育过程,解析其发育特征和规律,并筛选出可能在转录组和翻译组共同参与牛肌肉生长发育过程的关键基因,为后续功能基因的筛选和利用提供目标靶点。【方法】采集4月龄牛胚胎的骨骼肌卫星细胞的增殖期(proliferative period,GM)和分化期第2天(the second day of differentiation,DM2)的样品进行RNA-Seq和RNC-Seq分析,对其差异表达基因进行生物信息学分析,从翻译调控的角度分析与骨骼肌发育相关的差异基因。【结果】BSMSCs的DM2期相较于GM期差异基因筛选表明,转录组共筛选获得2808个差异基因(上调基因1749个,下调基因1059个),翻译组共筛选获得3740个差异基因(上调基因1769个,下调基因1971个),转录组和翻译组共有的差异表达基因725个,其中表达趋势相同的基因618个,表达趋势相反的基因107个。功能富集分析获得103个与骨骼肌发育相关的基因。进一步深入分析发现,转录水平的调控和翻译水平的调控具有相对独立性,且翻译调控对转录调控具有一定的回调作用,筛选获得了22个与牛肌肉的生长发育密切相关的标靶基因(CDK1、SERPINE1、THBS1、IGFBP3、CNB1、GADD45A、CYCS、CDK2、CCND1、CCNE2、ZMAT3、ACTB、ACTA1、TNNT1、MYH7、ACTG1、TUBA1C、TNNC1、KIF20A、TUBB4B、MYL3、TUBB3)及13个存在翻译回调现象的关键基因(GREM1、EGR1、SFRP4、NKD2、DKK3、IGFBP3、CTSK、ITGAV、CTSV、CDKN1A、SESN3、GADD45A、ZMAT3)。【结论】本研究筛选获得了22个可能与牛肌肉的生长发育密切相关的关键基因和13个存在翻译回调的关键基因,为进一步利用分子手段调节牛肌肉生长发育过程及进行新品种培育提供了重要的靶点。展开更多
文摘【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分,其生长发育直接影响畜禽肉产量,叉头转录因子O1(forkhead box protein O1,FoxO1)作为重要的转录调控因子,其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用,为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品,提取其RNA并反转录,利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞,通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒,以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达,其在成年牛的背脂中表达量最高,在背最长肌组织中表达量最低,且FoxO1在犊牛背最长肌组织中的表达量要极显著高于成年牛的(P<0.01)。亚细胞定位结果显示FoxO1在牛骨骼肌细胞的细胞核和细胞质内均有表达,其细胞核内荧光强度高于细胞质。成功构建FoxO1过表达载体,并完成FoxO1重组过表达腺病毒的包装与扩繁,在感染牛骨骼肌细胞后,能显著提高FoxO1表达水平(P<0.01)。EdU检测显示过表达FoxO1会显著降低细胞增殖率(P<0.01),流式细胞周期检测显示过表达FoxO1会显著增加G1期细胞数并减少S期和G2期细胞数,抑制细胞G1/S期的转化,并减少G2期细胞的形成。利用qPCR进一步检测发现,增殖相关基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2均极显著下调(P<0.01),促凋亡相关基因BAD和BAX显著上调以及抑凋亡基因BCL2显著下调(P<0.05)。过表达FoxO1导致牛骨骼肌细胞肌管形成量减少,qPCR检测结果发现,骨骼肌分化相关基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表达量显著下调(P<0.05)。【结论】FoxO1在牛的不同组织中均有表达,是一个广泛存在的转录调控因子,并且在背最长肌组织生长发育不同阶段存在表达差异,起到阶段调控作用。FoxO1在细胞核和细胞质中均发挥重要的转录调控作用,特别是在细胞核内。过表达FoxO1可能通过抑制细胞增殖相关基因和肌细胞分化相关基因的表达,从而抑制牛骨骼肌细胞的增殖与分化,并且可能通过上调促凋亡基因的表达和下调抑凋亡基因的表达来促使牛骨骼肌细胞凋亡的发生。
文摘【目的】利用转录组测序(transcriptome sequencing,RNA-Seq)和全长翻译组测序(ribosome-nascent-chain-complex sequencing,RNC-Seq)分析比对转录和翻译两个不同水平上牛骨骼肌的生长发育过程,解析其发育特征和规律,并筛选出可能在转录组和翻译组共同参与牛肌肉生长发育过程的关键基因,为后续功能基因的筛选和利用提供目标靶点。【方法】采集4月龄牛胚胎的骨骼肌卫星细胞的增殖期(proliferative period,GM)和分化期第2天(the second day of differentiation,DM2)的样品进行RNA-Seq和RNC-Seq分析,对其差异表达基因进行生物信息学分析,从翻译调控的角度分析与骨骼肌发育相关的差异基因。【结果】BSMSCs的DM2期相较于GM期差异基因筛选表明,转录组共筛选获得2808个差异基因(上调基因1749个,下调基因1059个),翻译组共筛选获得3740个差异基因(上调基因1769个,下调基因1971个),转录组和翻译组共有的差异表达基因725个,其中表达趋势相同的基因618个,表达趋势相反的基因107个。功能富集分析获得103个与骨骼肌发育相关的基因。进一步深入分析发现,转录水平的调控和翻译水平的调控具有相对独立性,且翻译调控对转录调控具有一定的回调作用,筛选获得了22个与牛肌肉的生长发育密切相关的标靶基因(CDK1、SERPINE1、THBS1、IGFBP3、CNB1、GADD45A、CYCS、CDK2、CCND1、CCNE2、ZMAT3、ACTB、ACTA1、TNNT1、MYH7、ACTG1、TUBA1C、TNNC1、KIF20A、TUBB4B、MYL3、TUBB3)及13个存在翻译回调现象的关键基因(GREM1、EGR1、SFRP4、NKD2、DKK3、IGFBP3、CTSK、ITGAV、CTSV、CDKN1A、SESN3、GADD45A、ZMAT3)。【结论】本研究筛选获得了22个可能与牛肌肉的生长发育密切相关的关键基因和13个存在翻译回调的关键基因,为进一步利用分子手段调节牛肌肉生长发育过程及进行新品种培育提供了重要的靶点。
