牛18ku-bFGF基因真核表达载体构建与鉴定

将牛18ku-bFGF基因全编码序列插入质粒pEGFP-N1中,构建真核表达载体pCMV-bFGF,并用菌落PCR、酶切和测序等方法对重组质粒进行了鉴定。研究结果表明,检测结果均一致于预期,表明牛18ku-bFGF基因全编码序列已正确插入到载体中。

牛妊娠相关糖蛋白18重组载体构建、表达条件优化和生物信息学分析

为了制备牛妊娠相关糖蛋白18(boPAG18),并预测其理化性质和功能,本试验优化密码子并合成boPAG 18基因,构建pET30a-boPAG18重组质粒。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的蛋白质表达量为指标,优化装液量、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度条件,采用亲和层析法纯化boPAG18,SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定。预测boPAG18的疏水性、信号肽、修饰位点、结构和蛋白相互作用。结果显示,经双酶切鉴定,pET30a-boPAG18重组质粒构建成功,boPAG 18基因1143 bp,表达蛋白约38 kDa。确定最佳表达条件为在OD 600 nm值为0.6,装液量为40 mL,IPTG终浓度为0.2 g/L,37℃诱导4 h。纯化的boPAG18纯度高达98%,浓度为2.63 mg/mL。该蛋白分子式为C_(1923)H_(3007)N_(519)O_(541)S_(17),分子质量为42.6 ku,等电点为9.31,亲水性平均值为-0.041,为两性蛋白,蛋白质不稳定指数为42.41,在水中不稳定;脂肪系数为88.43,有381个氨基酸;消光系数为47370 mol-1·cm-1,半衰期为30 h。boPAG18前15个氨基酸为信号肽,无跨膜区域;有糖基化修饰位点57个,磷酸化修饰位点68个,B细胞抗原表位13个,二级结构中α-螺旋占比19.42%、β-转角占比5.77%、无规则卷曲占比44.88%、延伸链占比29.92%;有7个相互作用蛋白,可能参与了母体在妊娠期的泌乳、抗菌和神经保护等调节功能。本试验为深入研究boPAG18的结构和功能提供了数据支持。

牛的巴贝斯虫18S rRNA基因序列比较研究

对中国已报道的8株牛的巴贝斯虫(包括1株牛巴贝斯虫、1株双芽巴贝斯虫、1株大巴贝斯虫、3株卵形巴贝斯虫和2株巴贝斯虫未定种)的18S rRNA基因序列进行了测定与比较.自感染动物的血液中纯化虫体,提取基因组DNA,PCR扩增靶基因,然后将其连接到pGEM-T Easy载体上,进行克隆测序.研究结果显示:牛的巴贝斯虫18S rRNA基因大小在1 653～1 699 bp之间;用所测得的和自GenBank下载的各种动物的巴贝斯虫18SrRNA基因序列构建了系统发生树,发现由刻点血蜱传播的大巴贝斯虫伊犁株与由长角血蜱传播的3株卵形巴贝斯虫存在明显差别,应属于2个独立种;由小亚璃眼蜱传播的牛巴贝斯虫未定种不同于目前已报道的任何种类,在中国应为一个新种.因而,中国存在5种牛的巴贝斯虫,即:牛巴贝斯虫,双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫,卵形巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种.

牛泰勒虫18S rRNA基因序列比较研究

作者对中国兽医微生物菌种保藏中心原虫资源库内收藏的3种牛源泰勒虫10个地方分离株（包括4株环形泰勒虫、3株瑟氏泰勒虫和3株中华泰勒虫）的18S rRNA基因序列进行了测定，并用所测得的牛的泰勒虫中国株基因序列和自GenBank下载的各种泰勒虫18S rRNA基因序列构建了系统发生树。结果显示：牛的3种泰勒虫18S rRNA基因大小在1740-1890 bp，并有规律地分布于3个不同的进化枝上，且种内地方分离株之间的同源性明显大于种间同源性，说明采用18S rRNA基因序列测定方法对牛的泰勒虫进行分类与传统分类方法具有较好的符合性。该研究也可为建立针对18S rRNA基因为靶标的牛的泰勒虫病PCR检测方法奠定基础。

牛白细胞介素18成熟蛋白cDNA基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术分别从脂多糖(LPS)活化的牛脾脏细胞和肺泡巨噬细胞中克隆到编码牛白细胞介素(bIL-)18成熟蛋白的cDNA基因,其大小为480 bp。将bIL-18克隆到pET32a(+)质粒中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,得到了分子量为38ku的融合蛋白,该蛋白经纯化并复性后,具有诱导MDBK分泌IFN-γ的活性,并且可以刺激ConA活化的外周血单核细胞(PBMC)增殖。使用半定量RT-PCR对其mRNA的体内表达进行了测定,发现不论是否加入刺激剂,牛巨噬细胞都可以持续的表达IL-18 mRNA,但是被LPS活化的PBMC只有微弱表达,肝和脾细胞经LPS活化后也可以检测到IL-18 mRNA的表达,其水平明显高于PBMC,在不同细胞中表达的差异可能反映了其产生成熟IL-18的能力。

牛IL-18基因的克隆及遗传进化分析

目的:克隆牛白细胞介素18(IL-18)全基因,并对其进行序列分析。方法:从ConA刺激培养的牛外周血淋巴细胞提取总RNA,利用巢式RT-PCR方法扩增出牛IL-18全长cDNA,将其克隆到pMD18-T载体上,测序后进行序列分析。结果:成功地克隆到了牛IL-18全基因,序列分析表明,实验中所克隆到的牛IL-18序列与GeneBank所登录的牛IL-18核苷酸序列及其推导氨酸序列同源性分别是99．5％和99％。与人、猕猴、野猪、山羊属、马等核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别在84．9％-99．5％和74．9％-99％之间,研究结果在国内还未见报道。结论:成功地从牛外周血中克隆到了牛IL-18的基因,其全长为598 bp。

牛精子头后部sp18族膜蛋白的分离

牛鲜精经钙离子载体Ａ２３１８７诱导的顶体反应后，水浴超声波和离心分离得到的精子头低渗处理后制备兔抗牛精子ＩｇＧ（抗ｓｐ１８ＩｇＧ）。激光共聚焦间接免疫组化定位显示牛鲜精经上述生化和物理处理后，剩余的膜蛋白基本位于头后部紧邻赤道板的大部分区域（ｓｐ１８质膜区域）和尾前段。ＳＤＳＰＡＧＥ结果显示：用３种去污剂协同提取得到的位于头后部ｓｐ１８质膜区域的膜蛋白主要有３种，分子量分别为１８，１６和１４ｋＤａ，薄层扫描发现它们约占牛精子质膜蛋白总量的６４％；ｓｐ１８单克隆抗体免疫印迹证明，这３种蛋白具有相同的抗原决定簇，故统称ｓｐ１８族膜蛋白；抗ｓｐ１８ＩｇＧ免疫印迹发现，除ｓｐ１８族抗原外，鲜精表面还存在一条６０ｋＤａ的杂交带，该蛋白带在顶体反应后消失；另外，牛精清的１４～１８ｋＤａ间的蛋白带和鸡卵溶菌酶（１４３ｋＤａ）也与抗ｓｐ１８ＩｇＧ有杂交信号。本方法的建立和ｓｐ１８单抗的生产，为进一步探讨ｓｐ１８族膜蛋白的基因结构及其在受精过程中的作用奠定了基础。

牛IL-18真核表达载体的构建及其对FMD疫苗的免疫增强作用

【目的】探讨牛IL-18(BoIL-18)对口蹄疫(FMD)灭活疫苗的免疫增强作用。【方法】PCR扩增BoIL-18蛋白基因片段,将其定向克隆至pcDNA3.1载体中,构建牛IL-18真核表达质粒pcDNA3.1-BoIL18。将pcDNA3.1-BoIL18与FMD灭活疫苗联合免疫小白鼠,同时设空载体和单纯接种FMD灭活苗组为对照,通过对口蹄疫抗体效价的检测、T淋巴细胞转化试验及NK细胞活性检测试验,研究BoIL18对FMD灭活疫苗的免疫增强作用。【结果】同时接种FMD灭活疫苗和IL-18真核表达质粒的小白鼠T淋巴细胞转化率和NK细胞活性,从接种第21天开始均明显高于单纯FMD灭活苗接种组(P<0.05),所产生的中和抗体效价从第28天开始与单纯接种FMD灭活疫苗组差异显著(P<0.05);空载体组与单纯FMD灭活疫苗组上述3项指标间无显著差异。【结论】牛IL-18真核表达质粒在小白鼠体内得到了良好表达,且表达产物对FMD灭活疫苗的免疫效果具有明显的增强作用。

抗牛精子sp18蛋白单链抗体基因的克隆及表达

应用重组噬菌体抗体技术，从小鼠抗牛精子sp18蛋白的A5杂交瘤细胞系中分离总RNA，构建重组噬菌体抗体库。以牛精子作为包被抗原，经过三轮“亲和吸附-洗脱-扩增”淘选后，用phage-ELISA筛选出特异性阳性克隆。取其中特异结合牛精子细胞的重组噬菌体抗体pCSA1克隆进行序列测定。将其ScFv(single chain fragment variable)因克隆到pET-30a(+)上，用IPTG进行诱导表达，成功得到了抗sp18单链抗体基因蛋白。

注射用母牛分枝杆菌+3HPCThV/18DThV方案对耐多药肺结核患者痰菌转阴率及血清T淋巴细胞亚群水平的影响

目的:探讨注射用母牛分枝杆菌+3HPCThV/18DThV方案对耐多药肺结核(MDR-TB)患者痰菌转阴率及血清T淋巴细胞亚群水平的影响。方法:选择2015年1月—2018年1月收治的MDR-TB患者120例,随机分为两组,每组60例。对照组予以3HPCThV/18DThV方案,观察组在对照组基础上加用注射用母牛分枝杆菌,比较两组痰菌转阴率、病灶吸收情况、血清T淋巴细胞亚群水平及不良反应。结果:观察组治疗3个月、18个月后痰菌转阴率高于对照组(P<0.05);观察组治疗18个月后吸收率高于对照组(P<0.05);观察组治疗18个月后CD3+,CD4+,CD4+/CD8+高于治疗前,且高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:注射用母牛分枝杆菌+3HPCThV/18DThV方案治疗MDR-TB,可通过增强机体免疫功能,促进病灶吸收,提高痰菌转阴率。

牛居油田牛18-1块储层特征研究

牛居油田牛18-1块油品性质好,勘探程度相对较低,具有一定增储增产潜力。该块油藏类型为构造-岩性油藏,为了进一步落实该块油层分布,对该块储层进行精细研究,系统地分析了该块沉积、储层、岩性、物性等特征,为指导下一步井位部署提供了依据。

云南省怒江州独龙牛内阿米巴原虫的感染情况调查

为了解云南省怒江州独龙牛内阿米巴原虫的感染情况,按照春、夏、秋、冬4个季节采集到的625份独龙牛粪便样本,用常规PCR方法,基于内阿米巴原虫的18S rRNA基因对粪便样本中虫体基因进行扩增。结果显示,检出内阿米巴原虫阳性样本共61份,总感染率为9.76%(61/625)。其中,鸠门当村、亚左洛村、古泉村、茨开镇、独龙江乡的感染率分别为4.12%(4/97)、7.59%(6/79)、11.18%(17/152)、13.54%(31/229)和4.41%(3/68),5个采样点之间,其感染率差异显著(P<0.05)。怒江流域与独龙江流域的内阿米巴原虫感染率分别为10.41%(58/557)和4.41%(3/68),差异不显著(P>0.05)。春、夏、秋、冬4个季节,独龙牛内阿米巴原虫的感染率分别为11.93%(26/218)、23.66%(22/93)、3.33%(4/120)和4.64%(9/194),差异极显著(P<0.01)。在阳性样本中,有51份鉴定为Entamoeba bovis,10份鉴定为Entamoeba sp.MG107/BEL。结果表明,云南省怒江州独龙牛存在内阿米巴原虫感染,应给予重视并建议采取有效措施进行防控。

四川省汶川县两种牛梨形虫的分离鉴定

自四川省汶川县黄牛体表采集长角血蜱的饥饿或半饱血成虫,带回实验室感染除脾牛。血液涂片检查发现,感染后第10 d,病牛血液中出现一种大型巴贝虫,感染后第24 d,出现一种小杆形的泰勒虫。形态学观察和18 S rRNA基因测序和进化关系分析证明,它们分别为卵形巴贝虫与瑟氏泰勒虫。

牛白细胞粘附缺陷病(BLAD)的调查

牛白细胞粘附缺陷病（BLAD）是一种常染色体单基因隐性遗传疾病，病因为白细胞表面整合素CD18亚单位基因突变所致。为了解我国奶牛群中BLAD的携带和发生情况，本研究采用RT—PCR扩增CD18基凶片段后，用TaqⅠ内切酶对扩增产物进行酶切的方法榆测了1000头1～6岁的奶牛，结果有19头奶牛为BLAD携带牛，即BLAD携带率为1．9％：1头为BLAD病牛。

牛不同组织中稳定性同位素氢、氧、硫组成探讨

为研究牛不同组织中氢、氧、硫稳定同位素的组成变化情况以及品种对其的影响,利用同位素比率质谱仪测定了不同部位脱脂牛肉、牛尾毛、血液、肝脏中的δ2H值和δ34S值及牛肉抽提水中的δ2H,δ18O值。结果显示,品种因素不影响组织中的硫同位素组成,但对氢同位素组成的影响尚不确定;肌肉不同部位、血液、肝脏、牛尾毛之间的δ2H值、δ34S值均有极显著差异,但各组织间的δ34S、δ2H值相关关系不明显;肉品水中δ2H值与δ18O值存在较强的相关关系。这些结果说明稳定性同位素氢、硫在牛不同组织中的分馏效应是不一致的,在进行牛肉溯源研究时,应根据研究目的和研究对象选择合适的组织。

牛中华泰勒虫新种(梨形虫亚目:泰勒虫科) 2.分子分类学研究

分离自我国甘肃中部地区土种黄牛的一种形态特异的泰勒虫,采用传统分类学研究鉴定为新种,被定名为中华泰勒虫（Theileria sinensis sp.nov.）。又利用对泰勒虫属特异的PCR引物（92/93）对该种基因组DNA扩增,结果表明该种属泰勒虫属原虫确定无疑,并对代表虫种进化和分类的18SrRNA基因序列进行了测定,对已测出该基因1067bp长片断序列与基因库中9种巴贝斯虫,7种已知牛泰勒虫的相应序列进行比较、分析,建立起系统发生树。树图表明,瑟氏泰勒虫和水牛泰勒虫的亲缘关系非常近,中华泰勒虫与这两个种的亲缘关系较近,与附膜泰勒虫、小泰勒虫、环形泰勒虫、斑羚泰勒虫、突变泰勒虫差异较大。

牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)的检测与单倍型分析

牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)是由常染色体上CD18基因单碱基突变(A→G)引起的隐性遗传疾病,隐性基因纯合时导致白细胞表面的β2整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病,患病牛的主要特征是机体免疫力降低、易患病从而影响生产性能的表现,严重的影响了奶牛场的经济效益。本研究重点对牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)的致病基因CD18基因第2外显子(exon2)进行检测分析,通过对样品进行PCR-SSCP分析,结果发现了4种单倍型:单倍型H1、H2、H3及H4,经测序发现,此扩增片段共存在2个SNPs位点,分别位于CD18基因exon2的C20T和A55G位点,其中C20T突变是首次发现,属于同义突变,而A55G突变即是引起BLAD的错义碱基突变,单倍型为H1、H2和H3的个体是正常牛,单倍型H4是BLAD携带者,从而建立了一种筛选BLAD有害基因的新方法-SSCP法。

黑龙江省某牛场种公牛牛白细胞粘附缺陷病(BLAD)的调查

BLAD（Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency）是一种遗传免疫缺陷性疾病,能够引起牛持续感染和严重影响牛生长发育,已给养牛业造成了巨大的经济损失。为了解黑龙江省家畜繁育指导站种公牛BLAD携带及其发生情况,采用RT-PCR扩增牛CD18部分基因片段后,用TaqⅠ对扩增产物进行酶切方法抽样调查了该繁育指导站3~6岁的100头种公牛,调查比例为76.5%,结果没有发现BLAD携带牛和BLAD病牛,说明该单位种公牛不存在BLAD和BLAD携带。

云南省独龙牛芽囊原虫分子流行病学调查

为了了解云南省怒江州独龙牛芽囊原虫的感染情况及基因型,试验分4个季节从怒江州怒江流域(古泉村、亚左洛村、鸠门当、茨开镇)及独龙江流域(独龙江乡)5个地点采集到987份独龙牛粪便样本,基于芽囊原虫的18S rRNA基因序列设计引物,采用常规PCR方法对粪便DNA进行扩增,琼脂糖凝胶电泳后对阳性样本进行测序分析。使用Clustal X 1.83软件和BLAST程序对测得序列在GenBank上与芽囊原虫参考序列进行同源性比对,通过MEGA-X软件计算序列之间的遗传距离,采用邻接法(NJ)构建系统进化树,以SPSS 19.0软件对感染率进行统计分析。结果表明:共得到119份芽囊原虫阳性样本,与GenBank中单峰驼芽囊原虫SSU rRNA基因序列(KC148207.1)相比,同源性为97.06%~98.92%;与牛芽囊原虫SSU rRNA基因序列(KC148205.1)相比,同源性为96.86%~98.19%,鉴定出ST10、ST14两种基因亚型。独龙牛芽囊原虫的总感染率为12.06%,其中古泉村、亚左洛村、鸠门当、茨开镇、独龙江乡感染率分别为7.28%、12.30%、19.27%、12.28%、9.20%,鸠门当采样点芽囊原虫的感染率与其他采样点比较差异显著(P<0.05)。独龙江流域与怒江流域的芽囊原虫感染率分别为9.20%、12.67%,两者比较差异不显著(P>0.05)。春夏秋冬4个季节芽囊原虫感染率分别为8.03%、11.39%、10.94%、18.22%,春季芽囊原虫感染率最低,冬季最高,两者比较差异显著(P<0.05)。说明怒江州独龙牛存在芽囊原虫感染,不同采样点的芽囊原虫感染率存在差异,冬季芽囊原虫感染率最高,需采取相应措施进行预防。

云南省独龙牛环孢子虫分子流行病学调查

为了了解云南省独龙牛环孢子虫(Cyclospora)的分子流行病学情况,试验分四个季节从云南省怒江流域(鸠门当、古泉村、茨开镇、亚左洛村)和独龙江流域(独龙江乡)共五个地点采集1129份独龙牛粪便样本,根据环孢子虫的18S rRNA基因序列设计引物进行巢式PCR扩增,以限制性内切酶BspEⅠ进行限制性片段长度多态性(RELP)分析。利用BLAST工具对测得的序列与NCBI上已发表的环孢子虫18S rRNA基因序列进行比对分析,通过生物学软件MEGA 6.0计算遗传距离并采用邻接法(NJ法)构建遗传进化树,以统计学软件SPSS对感染率进行分析。结果表明:从1129份粪便样本中共检测出17份环孢子虫阳性样本,对测得序列进行同源性分析发现,5份样本与人环孢子虫亲缘关系较近(98.5%~99.4%),11份样本与广州牛源环孢子虫亲缘关系较近(94.4%~98.8%),1份样本与其他种类环孢子虫亲缘关系较远。独龙牛环孢子虫的总感染率为1.51%(17/1129),怒江流域和独龙江流域的感染率分别为1.00%(9/903)和3.54%(8/226),两者比较差异显著(P<0.05);五个地点中,鸠门当与独龙江乡之间感染率差异显著(P<0.05),以独龙江乡的感染率最高,为3.54%(8/226);春、夏、秋、冬四个季节的感染率分别为0.74%(2/272)、2.90%(8/276)、0.64%(2/312)、1.86%(5/269),但差异不显著(P>0.05)。说明云南省独龙牛存在环孢子虫感染,地点是独龙牛感染环孢子虫的影响因素,独龙江乡的感染风险较高,当地应做好防控工作。