牛AsiaⅠ型口蹄疫克隆纯化疫苗的免疫效果检验

对牛AsiaⅠ口蹄疫克隆纯化疫苗的物理性状和无菌进行检验;采用豚鼠和小白鼠进行安全检验;并应用该疫苗在黄牛体内进行免疫效力检测。结果表明,应用克隆毒株研制的油乳剂灭活疫苗为乳白色,稳定、稀薄、无菌、安全而且在免疫效力方面克隆口蹄疫AsiaⅠ_AKT03毒株疫苗的PD50比普通疫苗提高2.4倍。

奶牛口蹄疫O-AsiaⅠ型双价疫苗母源抗体消长情况的观察

母牛在产犊后24 h内采血,犊牛出生后定期采血检测O型、AsiaⅠ型抗体。试验结果表明,犊牛吃初乳后,抗体效价迅速上升,以后随着日龄的增加,抗体不断下降;犊牛55日龄时,AsiaⅠ型达到保护抗体效价的牛比例为62.5%,75日龄时O型达到保护抗体效价的牛比例为62.5%。

甘南牦牛口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗免疫效果分析

为了解口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗对甘南牦牛的免疫保护情况，试验应用ELISA方法对30头牦牛不同免疫阶段的血清进行了抗体监测。结果表明：除免疫前口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗产生的抗体水平较低外，在一免后30天和二免后30，90，150天均能达到群体免疫保护水平，且在二免30天时最高，持续2～3个月后有下降趋势，在免疫5个月后下降至70．00％左右，但仍具有保护力。说明用甘南牦牛口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗免疫牦生产生的抗体水平符合国家规定的要求，且能维持较高水平，免疫效果良好。

西藏牦牛O型、AsiaⅠ型口蹄疫疫苗免疫抗体效价分析

为调查口蹄疫疫苗对西藏牦牛的免疫保护情况,应用口蹄疫液相阻断ELISA方法对随机选取的西藏五区一市844头牦牛的血清进行O型、AsiaⅠ型口蹄疫抗体水平检测。结果显示,西藏地区牦牛口蹄疫O型、AsiaⅠ型疫苗抗体具有50%以上保护力的比例分别为83.44%、71%,口蹄疫疫苗免疫状况良好,但西藏同一地区不同县、市的牦牛口蹄疫疫苗免疫情况存在较大差异。

奶牛AsiaⅠ-O型口蹄疫双价灭活疫苗免疫程序对比试验

本试验分4组进行了AsiaⅠ-O型口蹄疫疫苗免疫效果对比试验,结果表明,AsiaⅠ-O型FMD双价灭活疫苗对奶牛O型口蹄疫免疫效果好,一次免疫180d后还有较高的保护抗体;对奶牛AsiaⅠ型口蹄疫免疫效果差,抗体水平很难维持较高水平和较长时间。首免40d后加强免疫1次,以后每间隔4个月免疫1次,这种免疫程序比较适合衢州地区的奶牛口蹄疫免疫。

乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-Ⅰ型双价灭活疫苗免疫效果的检测与分析

[目的]研究乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-Ι型双价灭活疫苗的免疫效果。[方法]应用液相阻断ELISA法检测492份口蹄疫O型Asia-Ι型双价灭活疫苗的免疫效果。[结果]免疫牛群对牛口蹄疫O型的平均免疫合格率为97.6%,对Asia-Ι型的平均免疫合格率为97.7%。[结论]牛口蹄疫O型Asia-Ι型双价灭活疫苗可以使免疫牛产生有效的免疫保护。

口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。

检测AsiaⅠ型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析法的建立及应用

目的:建立一种快速、简便的检测AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)的胶体金免疫层析法(GICA)。方法:采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,用其标记纯化的AsiaⅠ型口蹄疫抗体后包被在玻璃纤维素膜上,另外将纯化的AsiaI型口蹄疫抗体和纯化的羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜按顺序组装成胶体金快速诊断试纸条,通过系列实验验证其灵敏度、特异性、重复性及稳定性。结果:研制的AsiaⅠ型口蹄疫快速检测试纸条对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的检测灵敏度为0.116mg/L,对阳性样品进行重复性试验3次检测结果完全相同。交叉反应证实该方法与其他血清型口蹄疫抗原和猪水疱病抗原(SVD)无交叉反应。检测田间样品,GICA与反向间接血凝的定型的符合率为96.87%。稳定性实验证实试纸条可保存12个月。结论:建立的GICA是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。

鉴别口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型的RT-PCR快速检测方法,根据GenBank中已登录的口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、AsiaⅠ型高度保守的2 B基因序列设计了1条共用反转录引物,根据3个血清型的VP1特异性基因序列,设计了3对型特异性引物对;以FMDV样本总RNA反转录产物为模板,建立了鉴别FMDV O、A、AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法。该方法灵敏度高,最低检测限均为100拷贝/μL;重复性和稳定性好;特异性强,与其他7个对照病原核酸均呈现阴性反应;可检测出10份疑似临床样品中3个血清型的FMDV感染样品。表明本试验成功建立了鉴别FMDV O型、A型、AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法,可用于临床上FMDV O型、A型、AsiaⅠ型的分型鉴别检测。

IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。

2017-2023年眉县猪、牛和羊O型口蹄疫免疫抗体监测与分析

为获知近年来眉县猪、牛和羊口蹄疫的免疫情况,对2017-2023年间全县8个镇(街)共7059份猪、牛和羊血清样品进行抗体检测,并从不同年份、不同季节、不同区域等角度对当地口蹄疫免疫抗体合格率进行比较分析。结果显示,2017-2023年眉县全域猪、牛和羊的口蹄疫免疫抗体合格率均高于70%。其中,牛和羊O型口蹄疫的免疫抗体合格率最高达100%且保持稳定,而猪O型口蹄疫免疫抗体合格率在个别镇(街)较低,低至45%,说明该县近7年间猪、牛和羊口蹄疫免疫抗体合格率总体达到农业农村部的标准(>70%),但针对猪应立即调整现行的免疫流程,加强集中免疫和日常补充免疫,以建立起县域有效的动物免疫保护屏障,确保养殖业健康发展。

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDVVP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。

AsiaⅠ型口蹄疫病毒江苏分离株VP1基因的克隆与高效表达

【目的】实现牛口蹄疫病毒AsiaⅠ型江苏分离株VP1基因在大肠杆菌中的表达,为VP1蛋白的深入研究奠定基础。【方法】根据GenBank公布的AsiaⅠ型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)核苷酸序列(登录号:AF030244),设计并合成1对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出牛AsiaⅠ型FMDV江苏分离株VP1基因,将其连接入pMD18-T载体,测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-VP1。阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳,利用West-ern-blot分析表达蛋白的抗原性。【结果】牛AisaⅠ型FMDVVP1基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物的相对分子质量约为43 ku,并能被牛AsiaⅠ型FMDV阳性血清识别,有一定的生物学活性,表达量约占菌体蛋白总量的37.7%。【结论】牛AsiaⅠ型FMDVVP1基因表达成功,且表达产物具有一定的生物学活性。

融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗的构建及其免疫应答

用小鼠模型评价融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗和不同免疫策略的免疫应答。用PCR方法扩增牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因,分别克隆到pMD18-T载体并测序验证正确后将其克隆到质粒pcDNA的相应位点获得质粒pcDNA-VP22-P12A3C。然后将BALB/c小鼠分成7组进行免疫。结果表明,DNA疫苗pcDNA-VP22-P12A3C诱导的细胞免疫水平超过了灭活疫苗,DNA疫苗与灭活疫苗联合免疫组体液免疫水平接近灭活疫苗组而细胞免疫水平远高于灭活疫苗组,为进一步研究VP22和P12A3C融合表达的基因工程疫苗奠定了基础。

羊O／P液中AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因3′端序列的分析

从宁夏中卫AsiaⅠ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液（OPF）中扩增得到了4个口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因3′-端483bp（VP483）片段。核苷酸和氨基酸序列比较结果表明，从4份OPF中扩增出的VP1片段，在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDVAsiaⅠ型流行毒相比均发生了改变，由RGD变成RDD。4个扩增片段的核苷酸序列与AsiaⅠ／js／WX／05株相比，同源性为96．2％～98、3％，表明与AsiaI／JS／WX／05株高度同源。蛋白结构模拟结果显示，这种改变会导致G—H环柔性减弱，这可能是AsiaⅠ／JS／WX／05FMDV适应羊体，造成持续感染后发生的一种变异。

口蹄疫O-A-AsiaⅠ型三价灭活疫苗免疫效力和最小免疫剂量的研究

为确定口蹄疫O-A-AsiaⅠ型三价灭活疫苗的安全性和免疫效果，按OIE口蹄疫疫苗效检标准和我国口蹄疫灭活疫苗质量标准，对实验室条件下制备的4批疫苗进行了安全性试验、免疫效力试验、免疫持续期试验、疫苗保存期试验和最小免疫剂量试验。结果显示，4批疫苗均对靶动物和实验动物安全，无任何毒副反应；对O、A、AsiaⅠ型口蹄疫的平均免疫效力分别为4．73、6．84和8．10PD50／头份；一次接种的有效免疫期达6个月；2～8℃下的疫苗保存期为12个月；适宜的免疫剂量为，6月龄以上牛每头3．0mL，6月龄以下牛每头1．5mL。该疫苗对接种动物安全，免疫效果良好，一次接种可同时预防O、A、AsiaⅠ型3个血清型的口蹄疫。

牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗与猪用口蹄疫O型灭活苗对猪的免疫效果比较试验

使用牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗与猪用口蹄疫O型灭活苗分别接种50d商品猪和怀孕90d种猪,免疫前和免疫后的3w及7w进行抗体水平检测。O型口蹄疫采用正向间接血凝试验、AsiaⅠ型口蹄疫采用液相阻断ELISA检测。同时对接种猪进行免疫应激观察。结果显示:猪使用牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗3W后口蹄疫AsiaⅠ的抗体水平十分低,最高只有5%,口蹄疫O型抗体合格率在35%以上;而注射猪用口蹄疫O型灭活苗的O型抗体水平合格率只有35%。而牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗两次接种后,Asia I和O型抗体水平均达到大于70%的要求。

奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗免疫效果对比试验

为了解兰州地区奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的免疫效果,科学评价免疫质量以及合理制定口蹄疫疫苗免疫程序,本研究应用液相阻断ELISA和O型正向间接血凝检测方法分别对目前兰州地区使用的4种口蹄疫二价灭活疫苗的免疫效果进行了对比。结果表明,兰州地区使用的4种口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的O型和亚洲Ⅰ型口蹄疫保护性抗体诱导能力参差不齐,其中以B公司O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的抗体诱导能力最强,其他3个公司的疫苗则相对较差。