动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

肠出血性大肠杆菌(EHEC)流行趋势(综述)

肠出血性大肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏ－ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＥ．ｃｏｌｉ，ＥＨＥＣ）是指能引起人的出血性肠炎的一群大肠埃希氏菌，以Ｏ１５７：Ｈ７血清型菌株为主，还包括Ｏ１５７：ＮＭ，Ｏ２６：Ｈ１１，Ｏ１１１：Ｈ８，Ｏ１２５：ＮＭ，Ｏ１２１：Ｈ１９，Ｏ４：Ｎ...

猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b(+)的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。

抑制肠出血性大肠杆菌感染的鸡源乳杆菌筛选及其抑菌机制

[目的]本文旨在筛选能够抑制肠出血性大肠杆菌黏附Caco-2细胞并抑制其诱导IL-8产生的乳杆菌。[方法]从健康鸡的肠道中分离菌株,通过双层琼脂法筛选出对大肠杆菌具有显著抑制能力的菌株,并进行16S rDNA鉴定。通过模拟胃肠液环境,评估分离菌株对胃肠液的耐受能力。通过FITC荧光标记大肠杆菌,对选定菌株抑制大肠杆菌黏附的能力进行测定,并利用ELISA试剂盒测定其对大肠杆菌诱导的IL-8过表达的抑制作用。[结果]10株乳杆菌对6株大肠杆菌的抑菌圈直径均大于10 mm,16S rDNA测序分析得到1株约氏乳杆菌、1株副植物乳杆菌和8株植物乳杆菌。其中Lactobacillus johnsonii NJ13对胃液耐受能力最佳,3 h的胃液存活率达73.19%;同时在肠液中能够生长,对肠出血性大肠杆菌ATCC35150黏附Caco-2细胞具有抑制作用,并能够显著降低由大肠杆菌诱导的IL-8表达量;可降低感染小鼠体内的大肠杆菌科比例(0.000205%),同时增加乳杆菌属的比例至3.11440%。[结论]L.johnsonii NJ13能够抑制大肠杆菌对细胞的黏附以及损伤,对有益乳杆菌资源的开发利用以及抑制肠出血性大肠杆菌的感染具有重要指导意义。

肠出血性大肠杆菌变种的RAPD分型研究

对4株肠出血性大肠杆菌(EHEC)进行随机扩增多态性(RAPD)分析,并结合主要毒力基因如eae和hly,以及志贺毒素滴度,探讨RAPD实验对大肠杆菌致病菌进行基因分型结果的可靠性。实验菌株中有两株变种携带stx基因但不能正常表达志贺毒素,其中一株变种EC169与另两株正常表达志贺毒素的O157菌株具有相似的扩增图谱,而另一株非O157变种EC130与其他菌株聚类明显不同。从20条随机引物中筛选出了重复性强且具有多态性的随机引物G2、G7、G8、G11、G12,可用于大肠杆菌致病菌快速鉴别和食物中毒溯源。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 eae基因原核表达及间接ELISA的初步建立

对肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7 LEE毒力岛上的eae基因进行克隆与原核表达,以表达产物紧密素(intimin)为包被抗原,初步建立O157∶H7血清抗体间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度为0.88μg/mL,血清最佳稀释倍数为200;与鸡大肠杆菌其他血清型O1、O2、O11、O18、O35、O45、O78、O86、O88、O147、鸡白痢以及新城疫等血清均无交叉反应,该方法特异性较好;血清稀释倍数为1 600倍时仍能检测到O157∶H7 intimin特异性抗体,该方法灵敏度较高。

检出山梨醇阳性肠出血性大肠杆菌O157:H7一例及特征分析

目的:肠出血性大肠杆菌O157:H7(entro-hemorrhaguc E.Coli O157:H7 or EHEC O157:H7)是具有强致病力的条件致病菌,该菌可通过污染的食物、水、以及直接接触感染的人或动物而感染。加强对该菌的检验,对预防与控制由该菌所致的感染流行十分重要。方法:本文参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0973-2000方法进行检验。结果:从进口冻猪肚中检出一例EHEC O157:H7,并用PCR方法检测VERO毒素呈阳性。结论:该菌株的生化特征与相关文献报道的EHEC O157:H7生化特征不同的是山梨醇阳性,棉籽糖阴性,检验过程中应慎重鉴别。

西藏牦牛肠出血性大肠杆菌HPI基因调查及耐药性分析

为明确西藏牦牛源肠出血大肠杆菌强毒力岛(HPI)基因以及ESBLs耐药基因携带情况,复壮笔者所在实验室保存的14株牦牛源肠出血性大肠杆菌,采用麦康凯培养基和伊红美蓝培养基进行筛选,镜检确定复壮成功后,应用PCR方法检测HPI携带情况,并对HPI相关毒力基因进行克隆与序列分析,测序结果同时采用K-B纸片法对被检菌株进行药敏试验和ESBLs表型检测,最后应用PCR方法进行ESBLs耐药基因检测。结果显示,14株被检菌株中HPI标志性基因fyuA的携带率最高,达42.86%(6/14),其次分别为ybtA、irp2和irp8基因,携带率均为21.43%(3/14),irp3携带率为14.2%(2/14),而未检测到irp5阳性基因。分离菌株对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、阿米卡星的耐药率均≥57.14%,对派拉西林、羧苄西林、头孢他啶、环丙沙星耐药率均≥21.43%,并存在多种耐药现象,耐药谱集中在3~10耐,其中6耐菌株最多,有5株,其次为8耐3株、7耐2株,10耐、9耐、5耐和3耐均1株。对被检菌株进行14种ESBLs类基因检测,结果发现被检菌株只携带1种ESBLs类基因,为bla;基因,携带率21.43%(3/14)。综上,西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌中存在HPI基因。对常用抗菌药产生较高的耐药性并存在多种耐药现象,但对ESBLs类药物具有较高的敏感性。

交叉引物等温扩增技术在肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的交叉引物等温扩增(Cross Priming Amplification,CPA)检测方法。方法根据EHEC O157:H7 stx1基因特征性保守序列(Gen Bank83460),设计交叉引物、剥离引物和检测探针,建立了EHEC O157:H7的CPA检测技术。用该方法检测19株细菌常见的食源性细菌,以验证其特异性;并用菌液浓度梯度稀释的方法对该方法的检测灵敏度进行评价。并通过60份食品模拟样品验证其在实际应用中的可性行,该检测结果与经典的细菌分离培养鉴定方法及常用的荧光定量PCR法进行比较。结果在检测的19株细菌中,只有EHEC O157:H7菌株的检测结果为阳性。其它菌株检测结果均为阴性,证明其特异性良好;通过浓度梯度稀释证明该方法检测的灵敏度可达l02cfu/m L;与分离培养鉴定法及荧光定量PCR法比较,其检测的灵敏度均为96.77%和96.67%、特异度分别为93.10%和90%、准确性分别为95%和93.33%。结论用于EHEC O157:H7的CPA检测体系具有简便、快速、灵敏、特异的优点,可用于进出境口岸现场及食品EHEC O157:H7的快速检测。

肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7体外抑杀的实验研究

本文报道了临床常用抗生素和生活中常用植物果蔬类对肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7的体外抑杀作用,研究发现蒜头液汁具有极强的抑杀效果。药物敏感试验表明,O_(157):H_7大肠杆菌对新霉素、链霉素、氯霉素、复方新诺明和呋喃妥因等高度敏感。

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)菌苗和肠出血性大肠杆菌(EHEC)菌苗研制现状(下)

1998年12月世界卫生组织(WHO)与日本四个医学研究所合作在日本召开一次国际会议,参加会议的有流行病学家、疫苗研制人员以及有关的管理、标准化和质量控制专家.会议讨论了ETEC/EHEC菌苗研制的最新进展并提出了建议,现择要介绍如下.

肠出血性大肠杆菌O104:H4感染的病原学特点和临床诊治进展

2011年5月初,德国暴发了规模较大的肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）疫情,随后波及法国、瑞典、美国、加拿大等16个国家。据世界卫生组织（WHO）报道,自2011年5月1日至7月7日共计报告3941例EHEC O104：H4感染病例,死亡48例,

用多糖间接血凝试验检测肠出血性大肠杆菌0157抗体的初步研究

目的：探讨多糖间接血凝(IHA)检测感染肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7患者血清中抗O157抗体的价值。方法：用酚-水法提取O157：H7脂多糖和醋酸水解法制备多糖抗原，致敏绵羊红细胞后以IHA检测各种肠道致病菌抗血清及健康人和非腹泻患者血清的抗体反应。结果：制备的多糖抗原糖含量为33％，不含核酸，蛋白质<0．3％，具有鲎试剂凝集活性。以O157多糖IHA检测O157单克隆抗体呈高效价凝集(1：1280)，H7多克隆抗体呈低效价凝集(1：8)；其它各种肠道致病菌抗血清的凝集效价均小于1：2；从30名健康人和30名非腹泻患儿的血清中未查出O157抗体；204名非腹泻成人患者中，有1人的凝集效价为1：8，其余的均小于1：2。吸收抑制试验表明凝集反应为特异性。结论：以多糖IHA检测抗O157抗体可试用于人群O157：H7感染的抗O157抗体流行率调查及肾溶血性尿毒综合征的免疫诊断。

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的临床研究

1982年肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7首次被确定是一种人类致病菌,该菌可通过食物、水,以及直接接触感染的人与动物而传播。全球已有6大洲30多个国家报道有该菌所致的感染流行。O157:H7感染的临床表现为无症状排菌、非血性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征(HUS)及死亡。

肠出血性大肠杆菌 O157 : H7 检验方法研究进展

１９８２年美国首次发生Ｏ１５７：Ｈ７型肠出血性大肠杆菌（ＥＨＥＣ）引起的食物中毒以后，该菌引起的食物中毒在美、英、德、加拿大、日本、澳大利亚、比利时、尼日利亚、土耳其、泰国等地不断发生，我国也分离到ＥＨＥＣ。１９９６年日本发生上万人的、全球最大的ＥＨ...

西藏牦牛源EHEC的MLST聚类和致病性分析

目的掌握西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌核酸多位点序列分型、聚类情况和致病性。方法对实验室已分离鉴定的14株肠出血性大肠杆菌采用分子生物学和动物实验的方法,进行多位点序列分型鉴定及聚类分析,动物实验后挑选致病性最强菌株进行生长曲线测定和半数致死量(LD 50)计算,HE染色制作组织病理切片。结果14株牦牛源肠出血性大肠杆菌中共出现了3种ST型,分别为ST 33、ST 226、ST 446,各ST型中西藏阿里菌株占比最多为57%(8/14);各ST型中ST 33占比最多为57%(8/14),其次是ST 226占比14%(2/14)该型菌株的致病性最强,ST 446占比最少为7%(1/14)。此外,还有3株占比22%(3/14)未定型肠出血性大肠杆菌。MLST聚类分析表明管家基因在不同ST型中携带等位基因的数量不同,ST 33型中Mdh 22个最多,ST 446型中icd 26个最多,ST 226型中Fumc 27个最多。14株菌株攻毒80只小鼠表现出不同程度的致病性,其中ST 226型致病性最强。将致死小鼠解剖后发现肠上皮出血水肿,脾脏、肝脏有淤血等病理变化。14株菌株中的阿里株(TBY 7)是ST 226型其致病性最强,其生长曲线显示14 h达最大生长数,浓度为1×10^(11)cfu/mL;60只小鼠差浓度梯度攻毒试验计算出该菌的LD_(50)为2.4×10^(7)cfu/mL。阿里株(TBY 7)ST 226型感染小鼠后经HE染色制作组织病理切片后,结果显示小鼠的十二指肠、盲肠、结肠和直肠黏膜上皮坏死脱落,盲肠肠壁内可见寄生虫,空肠、回肠绒毛结构坏死萎缩、固有层充血;肝细胞轻微空泡变性,脾脏红髓轻微淤血。结论西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌存在不同ST型,且各地区均有分布;不同ST型的致病性与携带等位基因数量相关,且主要引起肠组织病变,提示相关部门应加强对该致病菌的宣传。