非变性牦牛骨胶原蛋白的提取与表征

三股螺旋结构是胶原蛋白的关键结构特征,胶原蛋白变性会破坏三股螺旋结构进而严重影响其生物功能。牦牛是高寒地区特有的半野生牛种,主要生活在我国的青藏高原。我们开发了一种温和的生物工艺,从牦牛骨中提取制备了高品质的牦牛胶原蛋白(Yak ossein,YO)。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和圆二色谱(CD)结果表明,我们提取得到的为I型牦牛胶原蛋白,未发生降解,并且整体保持完整的三股螺旋结构。酶切实验进一步表明,提取的YO未发生变性,它可以有效抵抗胃蛋白酶的降解。同时,我们建立变性胶原蛋白的靶向结合实验,利用高特异性的荧光多肽探针来检测牦牛胶原蛋白的变性程度。该靶向探针对提取的YO完全没有结合能力,表明该YO为非变性胶原蛋白。细胞实验表明,YO对成纤维细胞有良好的粘附能力,并且可以显著促进其细胞增殖。

体外模拟消化对牦牛骨胶原蛋白肽抗氧化活性的影响

牦牛骨胶原蛋白经酶解产生的牦牛骨胶原蛋白肽有良好的抗氧化性,为评估其是否适合应用于营养品或保健品的开发,需要研究胃肠道消化对牦牛骨胶原蛋白肽抗氧化活性的影响。研究使用胃蛋白酶、胰液等物质对牦牛骨胶原蛋白肽进行体外模拟胃肠消化,采用水解度、分子质量分布、氨基酸组成对模拟消化前后牦牛骨胶原蛋白肽进行表征,并测定样品·OH清除能力、Fe^(2+)螯合能力及ABTS阳离子自由基清除能力以评估模拟消化对样品抗氧化能力的影响。结果显示,经过体外模拟胃肠消化后,对抗氧化性能起决定性作用的疏水氨基酸含量并无显著变化。分子质量>1000 Da的组分显著降低,且降幅超过50%;<500 Da的组分显著升高,分子质量介于180~1000 Da的主体部分无明显变化。消化前后除·OH清除能力无明显差异外,其他抗氧化性均有提高,表明严苛的胃肠消化不能破坏牦牛骨的抗氧化性功能肽。因此牦牛骨胶原蛋白肽适合应用于营养品和保健品。

牦牛骨胶原蛋白肽体外调节肠道菌群的研究

通过在体外构建模拟消化和发酵体系,研究牦牛骨胶原蛋白肽对小鼠粪便菌群体外厌氧发酵的影响。发酵过程中取样监测pH,乳酸和短链脂肪酸的含量变化。发酵结束后,采用16S rRNA高通量测序技术测定小鼠粪便菌群的组成。结果表明,添加牦牛骨胶原蛋白肽后,发酵液中短链脂肪酸的含量显著增多(P<0.01)。与未添加牦牛骨胶原蛋白肽的对照组相比,高剂量组的乙酸和丙酸含量分别增加86.7%,83.7%。此外,微生物多样性发生改变,粪便菌群组成也发生了显著变化。低剂量和高剂量组与对照组相比,在门水平上,放线菌门相对丰度分别上升69.3%和52%,在属水平上,双歧杆菌的相对丰度分别提高70.3%和52.4%。粪便菌群功能预测显示,小鼠粪便菌群的碳水化合物及氨基酸代谢功能有一定的提高。因此,牦牛骨胶原蛋白肽对小鼠肠道菌群可能具有一定的调节作用。

促成骨细胞增殖活性骨胶原蛋白肽的靶向筛选及活性分析

酶法制备的骨胶原蛋白肽为混合肽,通常具有多种潜在的生物活性,但目前缺乏基于促成骨细胞增殖活性的靶向性研究。本实验以酶法制备的牦牛骨胶原蛋白肽为原料,采用高效液相色谱法与纳米液相色谱-串联质谱法分别测定混合肽的分子质量与序列构成,基于与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的CDOCKER半柔性对接,靶向筛选具有潜在促成骨细胞增殖活性的骨胶原蛋白肽,并进行体外细胞增殖培养验证。结果表明,共鉴定得到78条牦牛骨胶原蛋白肽,主要以低分子质量肽段为主(小于3000 Da的组分占91.8%),通过与EGFR对接发现,多肽GPAGPQGPRGDKGETGEQ(GP-18,1736.815 Da)、TPEVDDEALEKFDK(TP-14,1634.775 Da)、GPAGPQGPRGDKGETGE(GP-17,1608.757 Da)、GKSGDRGETGPAGPAGPIGPV(GK-21,1875.951 Da)和GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVG(GK-22,1932.973 Da)具有潜在促成骨细胞增殖活性。小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞培养实验结果表明,3.0 mg/mL GK-22促成骨细胞相对增殖率达106%,显著高于空白组(P<0.05)。本研究可为促成骨细胞增殖活性肽的靶向筛选和工业化制备提供理论参考。

牦牛胶原蛋白-羟基磷灰石-海藻酸钠3D支架高效修复骨缺损

临界尺寸骨缺损的重建是组织工程中重要的挑战.胶原蛋白和羟基磷灰石复合支架因其具有良好的生物相容性、生物降解性和成骨性在骨组织工程中受到广泛关注.本研究中,我们开发了牦牛胶原蛋白-羟基磷灰石-海藻酸钠(YOHSA)三维(3D)多孔支架,对临界尺寸颅骨缺损具有良好的修复效果.以牦牛胶原蛋白(YO)为生物模板通过原位生物矿化,可形成具有良好纤维结构的纳米羟基磷灰石.YOHSA支架呈均匀的多孔结构,具有与天然骨相似的有机-无机成分,并表现出良好的生物相容性、增强的机械强度、适当的生物降解性、优异的细胞活性和显著的成骨分化能力.大鼠临界尺寸颅骨缺损模型的微型计算机断层扫描(micro-CT)和组织学染色结果均表明,YOHSA支架能显著促进骨组织的再生.这种高生物相容性和成骨诱导性的复合支架,在骨组织工程领域有广泛的应用前景.