eDNA监测测序数据分析注释中参考数据库选择、指标阈值选择、目标数据准备的影响——以长江中游鱼类为监测目标

在基于宏条形码(meta-barcoding)的eDNA监测技术中,eDNA测序数据的分析和注释是决定监测结果判断和评估精准与否的基础,而参考数据库选择、指标阈值选择、目标数据准备是eDNA测序数据分析和注释中最为关键的3个技术环节。为厘清上述3个技术环节处理方案的影响,本研究以长江中游2组eDNA监测COI基因测序数据为分析对象,针对鱼类的检出进行3组实验来分别检验:1)不同参考数据库及物种注释算法对注释结果的影响;2)不同OTU聚类序列相似度和物种注释分类置信度(序列一致性和序列覆盖度)对注释结果的影响;3)目标数据中各物种不同序列丰富度对注释结果的影响。结果显示:1)Blast算法下,3个版本nt库注释出的物种基本一致(72%~78%),2个本地序列参考库注释出的物种也基本一致(91%~96%),这5个序列参考库注释出的物种52%~68%一致;nt库RDP Classifier算法注释出的物种覆盖95%以上Blast算法注释出的物种,并比Blast算法注释出的物种多151%~443%,多出的物种大都是错误注释,本地参考数据库RDP Classifier算法注释出的物种覆盖66%~85%的Blast算法注释出的物种,并存在数条只注释到科属的结果。2)OTU聚类序列相似度阈值,取值0.999比取值0.99获得的OTU多154%~209%,注释到鱼类的OTU多240%~490%;注释分类置信度阈值(Blast算法,序列一致性和序列覆盖度)从0.8到0.99注释获得的物种组成(94%以上)基本一致,OTU组成(83%以上)也基本一致,注释分类置信度阈值取0.7时注释获得的物种组成、OTU组成与取0.8及以上时注释获得的有较大差异。3)在OTU聚类序列相似度阈值为0.999、注释分类置信度阈值为0.9时,多序列数据注释所得鱼类物种数、OTU数最多,物种注释正确率最高(达81.49%),分别比单序列数据的多7%、215%和高5%。在具体eDNA测序数据的分析和注释中,可通过建立完善本地参考数据库、优化OTU聚类序列相似度和物种注释分类置信度(序列一致性和序列覆盖度)取值、增加目标数据的丰富度来提高注释结果的准确性,但受制于物种注释算法的局限性,物种注释错误和注释遗漏的问题可能将长期存在,物种注释正确率通常低于85%(基于COI基因的eDNA监测)。