利用物种特异性PCR技术快速鉴定南瓜实蝇

【目的】快速鉴定我国进境植物检疫性害虫南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker),防止该虫传入扩散。【方法】基于物种特异性PCR(SS-PCR)技术,选取20种形态近似的常见实蝇,将南瓜实蝇作为阳性对照,提取基因组DNA模板,选用mt DNA COⅠ序列,检查同源系列,设计筛选1对可快速准确鉴定南瓜实蝇的种特异性引物NF404和NR610,并进行PCR检测和验证,建立一种利用种特异性引物的快速鉴定方法。【结果】南瓜实蝇在207 bp的位置扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余果实蝇未见条带。将截获的南瓜实蝇与其同亚属的近缘种具条实蝇、瓜实蝇的不同虫态和成虫部分虫体组织的虫样,采用本实验室建立的SS-PCR鉴定方法进行验证,结果一致。【结论】建立的南瓜实蝇的SS-PCR鉴定方法种特异性和稳定性强,能快速鉴定目标种类,解决口岸进境果蔬中截获实蝇幼虫、蛹等不同虫态和残体难于快速鉴定问题。

芝麻物种特异性定性PCR方法的建立

为鉴别食品中芝麻成分的真实性,建立了一套芝麻物种特异性定性PCR方法。根据Sesamum indicum 2S albumin-like序列,设计了3对芝麻物种特异性定性PCR引物,并对引物的特异性、最适反应浓度和最适退火温度进行了筛选和优化,建立了芝麻物种特异性定性PCR检测方法。进一步对方法的灵敏度、检出限和对芝麻加工品的适用性进行了测试。结果显示,引物sesame-1F/1R的特异性最好,最优反应条件为引物浓度0.4μmol·L^(-1),退火温度60℃;该方法能够检测出芝麻质量分数为0.1%的样品,且对于芝麻油、芝麻酱2种性状的加工样品均有很好的扩增。该方法能够鉴别食品中芝麻成分,为食品质量安全监管提供了有力的技术支撑。

基于物种特异性PCR对海鳗鱼糜掺假检测技术的研究

为了对海鳗鱼糜掺假进行定性研究,从GenBank数据库下载海鳗及其他物种的线粒体12S rRNA,并通过BioEdit 7.0软件对该基因碱基序列进行比对。在此基础上,综合考虑引物设计原则,设计出关于海鳗的特异性引物。对引物的特异性、灵敏性以及主要加工过程进行实验,结果表明所设计的引物对海鳗DNA具有很强的特异性,灵敏性达到0.1%,加工过程也不影响检测过程,从而满足了对于海鳗鱼糜掺假的检测要求。

基于位点特异性PCR技术的豹猫物种鉴定

建立一种简便、实用的豹猫物种分子鉴定方法。根据豹猫与中国其它猫科动物的Cyt b基因序列,对位排列分析,设计出1对特异性鉴别豹猫的位点特异性引物组合PB-idF/PB-idR。利用多重PCR扩增方法,结合猫科动物通用鉴定引物组合Fel-uF/Fel-uR,最后根据琼脂糖凝胶电泳的检测结果即可准确鉴别豹猫物种。研究结果显示,引物PB-idF/PB-idR具有高度的豹猫专属性,在野生动物保护及执法工作中具有较大的应用前景。

鳕鱼物种特异性鉴定的PCR方法研究

为了建立可对鳕鱼DNA进行特异性检测的PCR方法,应用在出口贸易中的鳕鱼疑似样品和保护执法工作中难以检查辨认的鳕鱼产品的物种鉴定,从GenBank数据库下载7个鳕属及其他5种鱼类的mtDNA细胞氧化酶Ⅱ(COXⅡ)基因序列,并用DNA Star7.0软件对上述不同鳕鱼的该基因碱基序列进行比较。在此基础上,综合考虑了设计引物的基本原则,选择了鳕鱼与其他鱼类碱基序列上差异位点较多的两个片段,设计出PCR引物。用该引物分别对从7种鳕鱼和5种非鳕鱼的肌肉、脏器组织中提取的DNA进行PCR扩增。结果表明,所设计的引物对鳕鱼DNA具有特异性,从而达到了对该物种进行特异性检测鉴定的目的。

基于物种特异性PCR技术检测鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的初步研究

目的建立一种可以鉴别鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的双重物种特异性PCR(species-specific Polymerase Chain Reaction,SS-PCR)诊断方法。方法基于鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌物种特异基因NFA_41530和O3I_RS18895分别设计特异性引物,通过优化反应条件和体系,建立快速准确的双重SS-PCR。对95株鼻疽诺卡菌、13株巴西诺卡菌和42株非目标菌株进行扩增,分析该方法的特异性和灵敏度,并通过模拟痰样本验证方法的准确性,预估其在临床诊断的价值。结果鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌质检分别扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余42株非目标菌株均未扩增,表明该方法具有很好的特异性。该方法对鼻疽诺卡菌、巴西诺卡菌的检测下限分别为1.3×10^(4)copies/μL、2.4×10^(4)copies/μL,灵敏度较高。使用20个健康人的痰液模拟痰样本,检测符合率为100%。结论基于NFA_41530和O3I_RS18895基因建立的双重SS-PCR方法特异性强、灵敏度较高,是一种可以同时鉴定鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的简便、快速、可靠、经济的方法。

咖啡特异性实时荧光PCR检测方法的建立

本研究通过对咖啡基因信息的检索分析,根据咖啡的XMT1基因序列设计了一组咖啡特异性的引物与探针,建立咖啡物种特异性实时荧光PCR检测方法。对该方法进行了灵敏度、特异性和稳定性测试,结果表明,该方法能快速检测出咖啡物种特异性,定性检测体系对咖啡DNA的检测灵敏度为0.1 ng/μL,特异性和稳定性良好。

多重PCR技术在鉴定菜豆中的应用

通过分析菜豆及其近缘种共21份植物材料的psbA-trnH基因序列,设计出一对菜豆的特异性引物。将叶绿体trnL和此对特异性引物结合进行多重PCR,结果表明可用于鉴定菜豆。

DNA技术鉴定动物物种研究评述

文中对DNA技术用于动物物种鉴定常用的限制性片段多态(RFLP)、随机扩增片段长度多态(RAPD)、扩增片段长度多态(AFLP)、扩增片段限制性长度多态(PCR-RFLP)、物种特异性引物扩增和直接测序法等6种方法进行了介绍,并对其研究状况和方法的优缺点进行了评述,指出了DNA技术用于动物物种鉴定存在的问题及发展方向.

一种检测近缘物种混合样品的新方法

结合双重PCR(Duplex PCR,dPCR)和扩增产物熔点的测定,建立了一种定量分析近缘物种混合样品中各物种相对含量的新方法。即针对混合样品中2种物种的DNA序列,各自设计高特异性引物,使2种物种的DNA同时进行PCR扩增而互不干扰,且扩增产物的熔点有足够的差别(>1℃);然后进行PCR扩增并测得不同温度下PCR产物同荧光染料结合后的荧光值;该荧光值对温度进行微分所得微分曲线上会产生2个峰(在两物种各自PCR产物熔点温度处),根据这2个峰的峰高比值同其相对含量的关系,即可完成对各物种含量的定量分析。本研究以长鳍和黄鳍金枪鱼的混合样品为例,对此方法的可行性进行了验证。结果表明,2种成分的含量比与对应峰值比之间线性关系良好;当混合样品中含有10%以上长鳍金枪鱼或5%以上黄鳍金枪鱼时,能够进行较准确的定量检测,证明了本方法切实可行。这一新方法解决了在混合样品中难以准确定量物种的难题,在食品安全和基因诊断领域有广泛的应用前景。

基于基因组特异性SSR序列的实蝇PCR鉴定方法

【目的】实蝇科昆虫是全球范围内重要的检疫性害虫,其幼虫取食寄主果实,引起果实腐烂、变质,造成巨大经济损失。由于口岸截获多为实蝇卵、幼虫、蛹等非成虫虫态,需饲养至成虫才能根据形态准确鉴定,因此快速可靠的分子鉴定技术体系亟需完善。【方法】利用公开发表的实蝇基因组序列,通过生物信息学方法从4种检疫性实蝇即地中海实蝇Ceratitis capitata、瓜实蝇Bactrocera cucurbitae、橘小实蝇Bactrocera dorsalis、昆士兰实蝇Bactrocera tryoni中挖掘物种特异性的简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR),针对各物种设计含有其特异性简单重复序列的引物,提取实蝇样品基因组DNA,采用常规PCR方法优化并筛选各物种特异性引物。【结果】在4种实蝇基因组中共发现20条物种特异性的SSR,基于这些序列设计的3对特异性引物能有效区分地中海实蝇、瓜实蝇和橘小实蝇,扩增片段大小分别为1 251、1 307、823 bp,而在其他物种中检测不到条带。【结论】基因组水平的序列分析发现了物种特异性的SSR,通过筛选获得物种特异性的PCR引物,可应用于3种实蝇的分子鉴定,为口岸检疫人员快速鉴定区分非成虫状态的实蝇提供了实用性技术。

物种特异性基因扩增鉴别掺假食用植物油

目的:建立特异的掺假食用植物油鉴定方法。方法:以掺假食用油中掺入的低价值食用油相应油料作物物种特异性基因为靶标,采用普通PCR(Polymerase Chain Reaction)方法鉴定掺入一种低价值食用油的混合油样,双重PCR技术鉴定掺入两种低价值食用油的混合油样。结果:在8个按2/3量掺入一种低价值食用油的混合油样中至少在一个平行样中检出低价值食用油相应的物种特异性基因,而按1/2比例掺入低价值食用油的8个油样中有5个检出混入的低价值食用油;3个按照1∶1∶1掺入两种低价值食用油的混合油样,其掺假检出率及平行样之间重现性均较差。结论:本研究选定的掺假植物油的检测靶标具有较强特异性,可有效鉴别大量掺入低价值食用植物油的掺假油品,但对于掺假量低于50%的油品,其掺假鉴别能力尚待提高。

水鹿的分子鉴定

本试验根据线粒体D-loop区序列,设计了针对水鹿的特异性扩增引物,通过聚合酶链反应得到296bp的特异性片段,而猪、牛、羊、鸡等常见动物和其他鹿科动物均无此条带,并通过DNA测序法对扩增结果进行了验证。结果证明,该方法可靠、特异、通用、简单,可作为水鹿的一种有效的鉴定方法,在水鹿的保护工作中具有一定的作用。

马铃薯成分微滴数字聚合酶链式反应定量检测方法建立

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术建立了定量分析马铃薯成分的检测方法。选取马铃薯的单拷贝光诱导组织特异性ST-LS1(light-inducible tissue-specific)基因作为目标基因,建立了马铃薯ST-LS1基因拷贝数浓度与马铃薯样品质量之间的线性关系;然后采用模拟样品验证该方法的准确性和适用性。结果表明:所设计的STLS1基因引物及探针具有良好的特异性,可对质量分数为5%及以上的马铃薯成分进行准确定量。此方法适用于市场监管中掺假鉴别及定量检测。

新疆棉花蚜虫-寄生蜂食物网结构的分子检测体系

为明确新疆棉花蚜虫-寄生蜂的食物网结构,通过设计新疆棉花蚜虫和寄生蜂的特异性引物,建立并优化可以在物种水平上开展棉花蚜虫-寄生蜂食物网结构分析的分子检测方法,该方法包括3个多重PCR检测体系(cMP1、cPriMP2和cHypMP3)和1个单一PCR(cSP1)检测体系,并应用建立的方法对采自库尔勒、阿克苏、昌吉的2383头僵蚜样品进行分子检测。结果表明,4个体系的灵敏度均较高,其中蚜虫cMP1体系的检出限为500 DNA拷贝数,初级寄生蜂cPriMP2体系的检出限为5000 DNA拷贝数,重寄生蜂cHypMP3和cSP1体系的DNA检出限分别为500拷贝数和100拷贝数。该方法能够快速且准确地鉴定4种棉花蚜虫、4种初级寄生蜂和7种重寄生蜂,特异性良好。使用该方法对供试僵蚜样品进行检测并成功绘制出新疆棉花蚜虫-初级寄生蜂-重寄生蜂食物网,定量分析了不同初级寄生蜂对蚜虫的寄生作用及重寄生蜂与初级寄生蜂之间形成的食物网络关系。表明所建立的分子检测方法可以用于评估不同种类寄生蜂在新疆棉花蚜虫种群控制中的生态功能,解析物种间的食物网关系。

我国濒危野生动物及其鉴定技术研究现状

濒危野生动物资源是我国自然资源的重要构成部分,但野生动物及其制品的走私和非法贸易威胁着野生动物的生存,导致部分物种濒临灭绝,需要快速准确的物种鉴定方法为海关、公安等执法部门提供技术支撑。目前,DNA物种鉴定技术是野生动物及其制品鉴定的研究热点。本文主要对DNA条形码、PCR-RFLP、物种特异性PCR、实时荧光PCR等技术进行了综述。