牲畜链霉菌异青霉素N合成酶基因的克隆与序列分析

产生含硫卜-内酰胺类抗生素的不同微生物种属间(包括原核和真核)的异青霉素N合成酶(IPNS)基因存在着明显的同源性。利用S. lipmanii IPNS基因探针验证了牲畜链霉菌(S. cattleya)染色体DNA中确实含有与之同源的区带,通过与牲畜链霉菌无活性阻断突变株互补克隆的方法,获得了同时含有硫霉素环化酶及IPNS基因的重组质粒。经基因序列分析表明牲畜链霉菌中IPNS基因,由963bp组成,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,共编码321个氨基酸,所克隆的牲畜链霉菌IPNS基因编码蛋白与已知的S. clavuligerus的IPNS相似性为56％,与S. lipmanii的IPNS相似性为64％。

牲畜链霉菌（Streptomyces cattleya）thienamycin合成阻断变株的筛选、阻断部位的确定及变株原生质体的研究

以ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ（ＴＮＭ）产生菌Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ为出发菌株，利用终浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ强诱变剂亚硝基胍在ｐＨ９．０、３７℃条件下对其孢子悬液处理３０ｍｉｎ，得到稳定的ＴＮＭ生物合成阻断变株Ｙ＿３。纸层析后进行茚三酮显迹和生物显迹表明Ｙ＿３变株积累一种无活性中间产物，其迁移率不同于ＴＮＭ。建立了Ｙ＿３变株中间产物的分离纯化方法。酸水解和氨基酸组分分析表明Ｙ＿３中间产物为谷氨酸和丙氨酸组成的二肽，可能是形成碳青霉烯双环母核的底物，提示丙氨酸可能也是ＴＮＭ的前体，Ｙ＿３变株阻断在形成碳青霉烯双环母核的环化步骤。Ｙ＿３变株具有较高的原生质体形成率和再生率。原生质体在４０℃进行处理可以在不影响再生率的前题下提高ＤＮＡ转化率。通过以上研究建立了以Ｙ＿３变株为宿主的ＴＮＭ环化酶基因克隆受体系统。

牲畜链霉菌一个调节基因的克隆及其顺式调控元件的研究

依据原核生物中广泛存在的调节基因ｌｕｘＩ保守性区域的氨基酸序列设计引物，以牲畜链霉菌总 ＤＮＡ为模板， ＰＣＲ扩增出约１８０ｂｐ片段．以此为探针，与总 ＤＮＡ不同酶切产物进行杂交，最终获得外源基因克隆至 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－） ＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ位点的重组质粒 ｐＳＮ１．序列分析发现一个 １８００ ｂｐ的完整 ＯＲＦ，（Ｇ＋Ｃ）％为 ６９． ３％，命名为ｓｃｔＩ． ＯＲＦ上游有 ２４９ｂｐ的 ＡＴ富集区，下游有复杂的二级结构．凝胶滞留实验证明 ＡＴ富集区有特异性的ＤＮＡ结合蛋白，且在低温聚丙烯酰胺凝胶电泳时可见“ＤＮＡ弯曲”现象，提示此ＡＴ富集区为一顺式调控元件。